高丹丹，安文強，陳 紅

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730030)

百合為百合科百合屬植物，是世界著名的藥食兩用的植物，始載于我國現(xiàn)存最早的藥物學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》，主要研究表明，百合中含有的甘油酯、甙類、生物堿及多糖等成分都具有重要的藥用價值，現(xiàn)代藥理學(xué)表明，百合具有養(yǎng)陰清肺、清心安神、止咳化痰、美容養(yǎng)顏的功效。百合中含有多種活性多糖，屬于植物性多糖，是由單糖之間脫水形成糖苷鍵［1］，具有非常重要的生理活性，具有明顯的補益作用和增強免疫的作用，同時具有降血糖、降血脂、抗疲勞、抗衰老等生物學(xué)功能［2］。百合多來源于栽培，也有少數(shù)為野生百合，蘭州是百合在西北的一個重要產(chǎn)地，其資源豐富，品質(zhì)優(yōu)越，儼然已成為蘭州的一大標(biāo)志性特產(chǎn)。蘭州百合在食用和藥用兩方面都具有非常大的價值。隨著社會的進步，人們已經(jīng)開始致力于對百合保健功能的研究，百合多糖的提取已經(jīng)引起了人們的注意。響應(yīng)面分析法是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件并且能研究幾種因素間交互作用的數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法，該方法實驗次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精度高［3－5］。目前，有關(guān)蘭州百合多糖的提取工藝報道大多數(shù)都是利用正交實驗對提取因素進行優(yōu)化［6－7］，極少有人采用響應(yīng)面分析法提取蘭州百合多糖。本研究在單因素的基礎(chǔ)上利用Box－Benhnken中心組合實驗設(shè)計原理對蘭州百合多糖提取工藝的參數(shù)進行優(yōu)化，以多糖的得率為響應(yīng)值，獲得最佳的提取工藝條件，為進一步開發(fā)、利用蘭州百合資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘭州百合干 蘭州市國芳綜超;葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無水乙醇、氯仿、正丁醇、無水乙醚 均為分析純。

電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學(xué)儀器廠;TGL－16M高速臺式冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司;723P分光光度計 上海光譜儀器有限公司;N－1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司;A－1000S抽濾機 上海愛朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘭州百合多糖的提取工藝 將百合干放入微型植物粉碎機中磨成粉末后，過70目篩，篩下物放4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?g百合干粉按一定料液比(浸提液用超純水)放入恒溫水浴鍋中浸提，浸提一定時間后取出，冷卻，裝入離心管中，于4000r/min離心10min，棄去雜質(zhì)，留其上清液，在上清液中加入3倍量的乙醇，置于4℃冰箱中靜置過夜［7］。抽濾并取沉淀，用一定量的蒸餾水沖洗濾紙，向溶液中加入配制好的Sevag試劑(氯仿/正丁醇體積比為5∶1)除蛋白直至無絮狀沉淀［8］，棄掉氯仿混合液層，重復(fù)操作3次，收集液體，加入3倍量的乙醇沉淀，再次放入4℃的冰箱中靜置過夜，抽濾得沉淀，所得沉淀依次用無水乙醇、無水乙醚淋洗，收集洗凈的沉淀，于冷凍干燥機中干燥，即可得粗百合多糖。

1.2.2 百合多糖含量的測定 采用苯酚－硫酸法測定蘭州百合多糖的含量［9］。計算公式如下:

多糖的提取率(%)=多糖的濃度(μg/mL)×溶液體積(mL)×稀釋倍數(shù)/原料質(zhì)量(g)×10－6×100

1.2.3 蘭州百合多糖提取工藝的單因素實驗 選取提取溫度(40、50、60、70、80℃)、提取時間(1、2、4、6、8h)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)3 個參數(shù)進行單因素實驗。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化蘭州百合多糖提取工藝 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取提取溫度、提取時間、料液比作為自變量進行三因素三水平的Box－Benhnken的中心組合實驗設(shè)計，水平分別以－1、0、1編碼，以百合多糖的得率為響應(yīng)值，實驗因素水平見表1。

表1 Box－Behnken實驗設(shè)計因素與水平Table1 Experimental design and variables levels for Box－Behnken

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同提取溫度對百合多糖提取率的影響 在固定提取時間為4h、料液比為1∶10的條件下，比較提取溫度分別為40、50、60、70、80℃時對百合多糖提取率的影響。實驗結(jié)果如圖1所示，可知從40℃起至60℃之間，百合多糖的提取率隨著溫度的升高而升高，且升高速度較快;在60℃后，百合多糖的提取率趨于平緩，由于考慮到溫度過高可能使多糖的活性發(fā)生變化，而且百合中的蛋白也易變性［10］，所以將最佳提取溫度定為60℃。

圖1 溫度對蘭州百合多糖提取率的影響Fig.1 Effect of temperature on the extraction rate of polysaccharide

2.1.2 不同的提取時間對百合多糖提取率的影響 在固定提取溫度為60℃、料液比為1∶10的條件下，比較提取時間分別為1、2、4、6、8h 時對百合多糖提取率的影響。結(jié)果如圖2所示。6h內(nèi)百合多糖的提取率隨著提取時間的延長而增大;當(dāng)提取時間超過6h，多糖的提取率略有下降，這是由于大部分多糖都已經(jīng)溶出并達到平衡，而且多糖逐漸被降解為單糖，所以多糖提取率不再提高而是略微下降［11］。多糖的提取時間過低時，由于細胞壁的破壞程度不夠，多糖不能夠完全溶出，提取率較低［12］?？紤]到節(jié)約資源，選取提取時間為6h。

圖2 提取時間對蘭州百合多糖提取率的影響Fig.2 Effect of time on the extraction rate of polysaccharide

2.1.3 不同的料液比對百合多糖提取率的影響 固定提取溫度為60℃、提取時間為6h，比較料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 對百合多糖提取率的影響。結(jié)果見圖3，百合多糖的提取率隨著料液比的升高而升高，可是在1∶25以后料液比對百合多糖提取率的影響趨于緩慢，多糖提取率有所下降，這是因為若加水過多，則提取液過多，降低了浸提效率，同時增大了醇沉?xí)r乙醇的使用量，造成了資源的浪費。所以選取1∶25的料液比為最佳料液比。

圖3 料液比對蘭州百合多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of Lily flour to solution(W/V)on the extraction rate of polysaccharide

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化蘭州百合多糖提取工藝

2.2.1 Box－Benhnken的中心組合設(shè)計實驗結(jié)果及分析 蘭州百合多糖提取工藝的響應(yīng)面分析實驗依據(jù)Box－Behnken中心法設(shè)計了17組實驗，其中包括5組中心點重復(fù)實驗，實驗的數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示。

利用Design Expert 6.0軟件對表2中的實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到回歸方程為:Y=12.09+0.58A+0.26B+0.60C－1.07A2－2.96B2－1.30C2+0.49AB+0.87AC+0.53BC

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及實驗結(jié)果Table2 Box－Behnken design matrix and the experimental results

對該模型進行方差分析，結(jié)果如表3所示。從模型的方差分析表可知，本實驗所選取的二次多項式模型具有高度的顯著性(p＜0.0001)。失擬項為0.3099＞0.05，故失擬項不顯著。決定系數(shù)0.9855，校正決定系數(shù)為0.9668，此數(shù)值說明本實驗?zāi)Ｐ涂梢越忉?6.68%響應(yīng)值的變化，只有總變異的3.32%不可以用此模型解釋，表明該模型的擬合度良好，可以使用此模型對蘭州百合多糖的提取工藝進行優(yōu)化。

表3 回歸模型方差分析表Table3 Variance analysis for the fitted quadratic Polynomial model

從回歸系數(shù)顯著性檢驗(表4)可知，A、C、A2、B2、C2、AB、AC和 BC八個因素對提取率的影響顯著，表明在百合多糖提取的過程中，溫度和料液比對提取率有顯著的影響;AB、AC和BC顯著，說明在提取的過程中，溫度和提取時間、溫度和料液比以及提取時間和料液比的交互作用也會對多糖提取率造成顯著影響。

2.2.2 響應(yīng)面與等高線分析 圖5～圖7是根據(jù)多元回歸方程所得到的不同因素對蘭州百合多糖得率影響的響應(yīng)面圖。通過該組圖可以對任意兩個因素及其交互作用進行分析和評價，并從中確定出最佳的因素水平的范圍。研究表明，等高線的形狀可以反映出交互作用的強弱，越趨向于橢圓表示交互作用越強，越趨向于圓形表示交互作用越弱［13－14］。

圖5表明了提取溫度和提取時間對百合多糖得率的交互作用，由圖可知，等高線的形狀呈橢圓，說明了提取溫度和提取時間之間的交互作用顯著。當(dāng)提取溫度不變時，提取率隨著提取時間的增大而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;當(dāng)提取時間不變時，提取率隨著提取溫度的增大而呈現(xiàn)上升的趨勢，溫度上升到一定值，百合多糖的提取率變化趨于平緩。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table4 Regression coefficients and their significance of the quadratic model

圖5 溫度和時間交互作用對百合多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plot for the effects of variables on extraction rate of polysaccharide versus temperature and time

圖6表明了提取溫度和料液比對百合多糖得率的交互作用，由圖可知，等高線呈橢圓形，說明了提取溫度和料液比之間的交互作用顯著。當(dāng)提取溫度較低時，百合多糖的提取率隨料液比的增加呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢;當(dāng)提取溫度較高時，百合多糖的提取率隨著料液比的增加而呈現(xiàn)上升趨勢，而后多糖提取率的增加趨于平緩。當(dāng)料液比較低時，百合多糖的提取率隨著溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;當(dāng)料液比較高時，百合多糖的提取率隨著溫度的升高而呈現(xiàn)上升的趨勢，達到一定的溫度后，上升的趨勢趨于平緩。

圖7表明了提取時間和料液比對百合多糖得率的交互作用，由圖可知，因為其等高線呈橢圓形，說明了提取時間和料液比的交互作用比較顯著。當(dāng)提取時間不變時，百合多糖的提取率隨著料液比的增大而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;當(dāng)料液比不變時，百合多糖的提取率隨著提取時間的增加而呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢;由響應(yīng)面圖可知，后者增大或減小的趨勢要比前者略微明顯。

圖6 溫度和料液比交互作用對百合多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface plot for the effects of variables on extraction rate of polysaccharide versus temperature and Lily flour to solution(W/V)

圖7 時間和料液比交互作用對百合多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface plot for the effects of variables on extraction rate of polysaccharide versus time and Lily flour to solution(W/V)

2.3 驗證實驗

根據(jù)Box－Behnken實驗所得到的數(shù)據(jù)結(jié)果和回歸方程，利用Design Expert6.0軟件處理所得數(shù)據(jù)，從中可以獲得一組最佳的蘭州百合多糖的提取條件:溫度為64.7℃、時間為6.12h、料液比為1∶30，在此條件下得到的蘭州百合多糖的得率為12.37%。為了驗證響應(yīng)面法的可行性，用實驗得出的最佳條件進行蘭州百合多糖提取的驗證性實驗，通過3組平行實驗得到的百合多糖提取率為12.28%、11.73%、12.05%，平均提取率為12.02%，與理論計算值的誤差在±1%以內(nèi)，可見該模型可以較好地預(yù)測實際多糖提取率的情況。

3 結(jié)論

本研究在單因素實驗的基礎(chǔ)上，確定了提取溫度為60℃、提取時間為6h、料液比為1∶25。用 Box－Benhnken設(shè)計三因素三水平的實驗，利用Design－Expert6.0進行多元回歸擬合，得到蘭州百合多糖得率和各影響因素的多元二次回歸方程為:Y=12.09+0.58A+0.26B+0.60C－1.07A2－2.96B2－1.30C2+0.49AB+0.87AC+0.53BC。方差分析表明，該模型可以較好的反映出提取溫度、提取時間、料液比與百合多糖得率的關(guān)系。并對蘭州百合多糖的提取工藝進行了優(yōu)化，得到最佳提取條件為:溫度64.7℃、時間為6.12h、料液比為1∶30，在此提取條件下，百合多糖的得率可達到12.37%，而經(jīng)驗證實驗所得到的實際值為12.02%，此實驗的理論值與實際值相差不大。實驗證明，響應(yīng)面分析法可以有效地對蘭州百合多糖的提取工藝進行優(yōu)化，這對進行生產(chǎn)實踐具有一定的指導(dǎo)意義。

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