鄒 宇，尹冬梅，胡文忠，姜愛麗，陳 晨，顧振新

(1.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600;2.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095)

黑色素是廣泛存在于生物體中的一類天然色素，通常是由多酚或吲哚化合物氧化聚合而形成，具有分子量高、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn)［1］。許多研究證實(shí)，生物體內(nèi)的黑色素具有抗氧化、抗輻射、抗病毒、提高免疫力等許多重要的生理功能，具有廣泛的開發(fā)應(yīng)用潛力［2］。黑木耳子實(shí)體是一種黑褐色可食用的大型真菌，其含有豐富的黑色素，是中國越來越流行的“黑色食品”之一。目前，有許多關(guān)于黑色素分離和特性研究的報(bào)道，并且黑色素被認(rèn)為是這些黑色食品中最重要的功能成分之一［3］。然而，有關(guān)黑木耳子實(shí)體中黑色素的研究報(bào)道卻很少見，且多數(shù)研究集中于色素的提取和初步的理化性質(zhì)分析［4－5］。迄今為止，黑木耳黑色素的抗氧化等功能特性方面的研究尚未見報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)對(duì)黑木耳天然黑色素的理化性質(zhì)和抗氧化活性進(jìn)行較為全面的研究，旨在為天然功能性色素的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑木耳子實(shí)體干品 黑龍江省東寧縣市場(chǎng)，粉碎后過40目篩;亞油酸、2，2'－偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH) 美國sigma公司;羥自由基測(cè)定試劑盒 南京建成生物有限公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

CR－400色差計(jì) 日本柯尼克美能達(dá)公司;UV－2802紫外可見分光光度計(jì) 美國尤尼科公司;KQ250－DB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TDL－40B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;GHH－6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 黑木耳天然黑色素提取與純化

參照Zou等［6］的提取與純化方法。黑木耳子實(shí)體干粉加入蒸餾水(液固比為43∶1，mL/g)，NaOH調(diào)pH為12，43℃超聲(功率 250W)提取 36min，樣品4000r/min離心 5min，HCl調(diào) pH 為 2，4000r/min離心5min，得黑色素粗品。黑色素粗品用7mol/L HCl 100℃下水解 2h，離心(10000r/min，20min)，沉淀先后用氯仿、乙酸乙酯和乙醇洗滌。純化后的黑色素凍干并于－20℃保存。

1.3 黑木耳天然黑色素的理化性質(zhì)

1.3.1 粉末顏色 黑色素粉末的外觀顏色通過色差計(jì)測(cè)定，色差值采用L*、a*和b*表示。

1.3.2 溶解性 根據(jù)Wang等［7］的測(cè)定方法略作修改，100mg黑色素加入10mL水、酸(pH ＜3)、堿(pH＞8)和常見的有機(jī)溶劑(乙醇、甲醇、氯仿、丙酮、乙醚、石油醚、苯、乙酸乙酯、正丁醇)中，攪拌1h，靜置0.5h，觀察黑色素的溶解情況。

1.3.3 熱穩(wěn)定性 將50mg/L的黑色素溶液(pH9.0)分別置于25、50、75和100℃的恒溫水浴中保溫4h，每隔1h取樣，參考Wang等［7］的黑色素測(cè)定方法，測(cè)定樣品400nm吸光度值。

1.3.4 光穩(wěn)定性 將50mg/L的黑色素溶液(pH9.0)分別置于暗處(對(duì)照)、自然光和白熾燈光(300lx)下照射5d，在0、1、3和5d時(shí)分別取樣，測(cè)定400nm 吸光度值［7］。

1.4 黑木耳天然黑色素的抗氧化活性

1.4.1 還原力 在 Oyaizu等［8］方法基礎(chǔ)上適當(dāng)調(diào)整。取黑色素溶液1mL，依次加入3.0mL 0.5mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和2.5mL 1%六氰合鐵酸鉀溶液，50℃保溫20min，再加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液，3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸餾水，0.5mL 0.1%三氯化鐵溶液，靜置10min，700nm下測(cè)定吸光度值。

1.4.2 羥自由基清除能力 采用羥自由基測(cè)定試劑盒，F(xiàn)enton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，H2O2的量與羥自由基量呈正比，當(dāng)給予電子受體后，用griess試劑顯色，形成紅色物質(zhì)，其呈色與羥自由基的量成正比關(guān)系。式中，A0為空白樣品反應(yīng)后吸光度值;A1為樣品反應(yīng)后吸光度值。

1.4.3 脂質(zhì)過氧化抑制能力 參考Gabrielska等［9］的測(cè)定方法。取1mL樣品溶液于10mL具塞試管中，依次加入2mL 2.51%亞油酸無水乙醇溶液，4mL 0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，2mL蒸餾水，0.417mL 0.1mol/L AAPH，密閉后置于暗處，37℃保溫200min。取0.1mL混合溶液，加入9.7mL 75%的乙醇和0.1mL 30%硫氰酸鐵，再加入0.1mL 0.02mol/L氯化亞鐵(溶解于3.5%鹽酸中)，混勻后反應(yīng)5min，500nm測(cè)定吸光度值。

式中，A0為空白樣品吸光度值;A1為樣品反應(yīng)后吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳天然黑色素的理化性質(zhì)

2.1.1 顏色 色差計(jì)測(cè)定結(jié)果中L*表示亮度，a*表示紅/綠，b*表示黃/藍(lán)。由表1可知，L*值較大，而a*值和b*較小，這表明黑木耳黑色素是趨近于黑色并略帶紅色和黃色的固體粉末。黑木耳子實(shí)體生長(zhǎng)在自然環(huán)境中的固體培養(yǎng)基上，其黑色素包含了一些其它物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、碳水化合物和金屬離子等［10］，這些物質(zhì)已經(jīng)成為黑木耳黑色素的一部分，因此表現(xiàn)出紅色或黃色等多種顏色。

表1 黑木耳黑色素的外觀顏色Table1 Color values of A.auricula melanin

2.1.2 溶解性 黑木耳黑色素不溶于水，也不溶于乙醇、甲醇、氯仿、丙酮、乙醚、石油醚、苯、乙酸乙酯、正丁醇等常見的有機(jī)溶劑，但極易溶解于堿性溶液(pH＞8)中，而在pH小于3的酸性溶液中沉淀。黑木耳黑色素的溶解性與報(bào)道的烏骨雞［10］、紅茶葉［11］、山杏種皮［12］中黑色素的溶解性十分相似。

2.1.3 熱穩(wěn)定性 由表2可知，黑木耳黑色素在25℃加熱4h僅損失4.7%，隨著加熱溫度的升高和加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，黑木耳色素的保存率有所下降，但在100℃加熱4h后，色素保存率仍達(dá)到88.0%，這表明黑木耳黑色素較為耐熱，具有一定的熱穩(wěn)定性，這與張金萍等［13］的研究結(jié)果相一致。

2.1.4 光穩(wěn)定性 光照是對(duì)色素穩(wěn)定性影響比較顯著的因素之一。由表3可知，黑木耳黑色素在暗處保存5d，其損失率不超過1%。但是在自然光下存放僅1d，色素?fù)p失率就達(dá)到了16.0%，存放5d時(shí)殘存的黑色素僅為25.3%。黑木耳黑色素在白熾燈照射下，具有與自然光照射時(shí)相似的變化規(guī)律，白熾燈照射5d時(shí)黑色素殘存率為55.4%，這表明光照對(duì)黑色素的破壞作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，且光照強(qiáng)度越高，破壞程度越大。這可能是由于黑木耳黑色素在光照過程中其結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，導(dǎo)致穩(wěn)定性降低［14］。

表2 溫度對(duì)黑木耳黑色素穩(wěn)定性的影響Table2 Effect of temperature on stability of A.auricula melanin

表3 光照對(duì)黑木耳黑色素穩(wěn)定性的影響Table3 Effect of different light sources on stability of A.auricula melanin

2.2 黑木耳天然黑色素的抗氧化活性

2.2.1 還原力 測(cè)定還原力是為了檢驗(yàn)樣品的電子供應(yīng)能力，還原力強(qiáng)表明樣品可供應(yīng)較多的電子。這些電子可使Fe3+還原為Fe2+，同時(shí)參與自由基反應(yīng)，使自由基變成更加穩(wěn)定的物質(zhì)。從圖1可以看出，黑木耳黑色素的還原力隨著添加濃度的增大而成正比例上升趨勢(shì)，這表明黑木耳黑色素是良好的電子供應(yīng)者，能提供電子并將自由基轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的產(chǎn)物，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

圖1 黑木耳黑色素的還原力Fig.1 Reducing power of A.auricula melanin

2.2.2 羥自由基清除能力 羥自由基通常產(chǎn)生于抽氫反應(yīng)和加成反應(yīng)過程中，其可輕易通過細(xì)胞膜，并與細(xì)胞內(nèi)的碳水化合物、蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。由圖2可知，在0.2～1.0mg/mL濃度范圍內(nèi)，黑木耳黑色素對(duì)羥自由基的清除率在30%～50%之間，這與提取自紅茶葉中黑色素的羥自由基清除率相同［15］。

圖2 黑木耳黑色素清除羥自由基能力Fig.2 Hydroxyl radical－scavenging activities of A.auricula melanin

2.2.3 脂質(zhì)過氧化抑制能力 脂質(zhì)過氧化可使細(xì)胞膜內(nèi)的磷脂、酶、多不飽和脂肪酸和核酸等發(fā)生改變，降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由圖3可見，黑木耳色素濃度在0.6mg/mL以下時(shí)，脂質(zhì)過氧化抑制率隨添加濃度的增加而增大，但當(dāng)濃度超過0.6mg/mL時(shí)，脂質(zhì)過氧化的抑制率保持在43%左右不變，此抑制率略低于烏骨雞黑色素的脂質(zhì)過氧化抑制率［10］。

圖3 黑木耳黑色素抑制脂質(zhì)過氧化能力Fig.3 Lipid peroxidation－inhibiting activities of A.auricula melanin

3 結(jié)論

提取并純化了黑木耳子實(shí)體中的天然黑色素，色差計(jì)測(cè)得黑色素粉末呈黑色，略帶紅色和黃色，不溶于水和有機(jī)溶劑，僅溶于堿性溶液;黑木耳黑色素具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，但對(duì)光照敏感，長(zhǎng)時(shí)間強(qiáng)光照射可引起黑色素大量損失;黑木耳黑色素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，還原力隨添加濃度的增加而增大，1.0mg/mL濃度的黑色素溶液羥自由基清除率和脂質(zhì)過氧化抑制率均在40%以上。

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