強(qiáng) 毅，王政軍，陳克克，韓 軍，孫鐵峰

(1.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062;2.西安文理學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，陜西西安 710065)

植物多酚(Plant Polyphenols)是多羥基酚類(lèi)化合物的總稱(chēng)，是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物，分子內(nèi)含有多于一個(gè)或幾個(gè)苯環(huán)相連的羥基化合物［1］，具有很好的抗菌消炎、抗氧化、酶活性抑制、防輻射突變、抗衰老、降血壓、增強(qiáng)免疫力等作用，可預(yù)防與治療多種疾病，在食品工業(yè)中作為天然添加劑被廣泛用作防腐劑、抗氧化劑和澄清劑等［2－3］。費(fèi)菜(Sedum aizoon L)為景天科(Crassulaceae)景天屬(Sedum)多年生草本植物，分布于陜西、江蘇、河南、湖北、寧夏和山東等多個(gè)省區(qū)，以根及全草入藥，為秦嶺“太白七藥”之一，具有散瘀止血、安神、解毒之功效，含有黃酮與酚類(lèi)、生物堿、谷甾醇、齊墩果酸、景慶庚糖等藥用成分，主治出血、損傷、心悸、失眠、毒蟲(chóng)蜇傷等癥［4］;費(fèi)菜莖葉可食，被收于明朝朱橚所著《救荒本草》，作為野生蔬菜具有心血管保健的功效，被稱(chēng)為養(yǎng)心草［5］，同時(shí)也是多酚的資源植物之一［6］。本文使用福林酚法(Folin－Ciocalteu，F(xiàn)C)對(duì)費(fèi)菜不同部位70%甲醇提取物中的多酚含量予以測(cè)定，并采用牛津杯法、MIC和MBC法綜合評(píng)價(jià)費(fèi)菜提取物對(duì)10種細(xì)菌的抑制作用，以期為綜合開(kāi)發(fā)利用費(fèi)菜資源提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物材料 采自陜西省西安市灞橋區(qū)，經(jīng)陜西師范大學(xué)田先華教授鑒定為景天科景天屬植物費(fèi)菜(Sedum aizoon L.)，干燥后將其地上、地下部分分離，粉碎并過(guò)40目篩，保存?zhèn)溆?蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)A18、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A20、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)A21、大腸桿菌(Escherichia coli)A70、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)A89、白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)A113、藤黃八疊球菌(Sarcina luteu)A119、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)26003、表皮葡萄球菌(Staphyloccocus epidermidis)1.2429、肺炎克雷伯氏菌(Keleiboshijun ganran)1.1736 北京微生物研究所;沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所;Folin－Ciocalteu試劑 上海荔達(dá)生物科技有限公司;四環(huán)素 Wolsen公司;二甲基亞砜(DMSO) Sigma公司;Mueller－Hinton Agar培養(yǎng)基(MHA)、MH 肉湯培養(yǎng)基(MHB) 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;甲醇 西安化學(xué)試劑廠(chǎng);其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

TU－1810紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FZ102微型植物粉碎機(jī) 黃驊市中興有限責(zé)任公司;Q/BKYY31－2000型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng);SL202N型藥物電子天平 上海明橋精密科學(xué)儀器有限公司;HH－6B數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;索氏提取裝置，超凈工作臺(tái)，不銹鋼數(shù)顯卡尺等，牛津杯(內(nèi)徑6mm，外徑7mm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多酚含量測(cè)定

1.2.1.1 樣品溶液的制備 精確稱(chēng)取費(fèi)菜地上與地下部分植物材料各10.0g，分別使用70%甲醇100mL熱回流提取兩次，每次3h，過(guò)濾后合并濾液，定容至200mL，即為費(fèi)菜不同部位多酚提取液。

1.2.1.2 沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液的配制 精確稱(chēng)取已烘干至恒重的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%)13mg，用甲醇溶解并定容至50mL，即得終濃度為0.26mg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.1.3 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 分別精密吸取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0、0.1、0.4、0.5、0.6、0.8mL 置于25mL量瓶中，向量瓶中依次加入10.0mL蒸餾水，再各加入Folin－Ciocalteu顯色劑2.0mL，充分振蕩后靜置6min，分別加入15%Na2CO3溶液2.0mL，蒸餾水定容后搖勻，在室溫下避光放置反應(yīng)2h。以第1瓶溶液作為空白對(duì)照，于765nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，重復(fù)3次。根據(jù)沒(méi)食子酸溶液的濃度和吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.1.4 樣品的含量測(cè)定 分別取樣品溶液50μL，按照1.2.1.3沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定費(fèi)菜樣品中多酚的含量，重復(fù)3次。

1.2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 分別取3份地下部分樣品，參考1.2.1.1樣品溶液的制備方法，1.2.1.4樣品的含量測(cè)定方法，在相同的條件下分別進(jìn)行6次平行測(cè)定，檢測(cè)方法的精密度。

1.2.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將上述樣品溶液每隔1h測(cè)定1次吸光度，重復(fù)3次，連續(xù)測(cè)定4次，考察4h內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.2.1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別取3份樣品，參考1.2.1.1樣品溶液的制備方法平行制備，分別測(cè)定吸光度，考察其重復(fù)性。

1.2.1.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取25μL已知濃度的樣品溶液各3份，各組分別精密加入已知含量沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液25μL，按1.2.1.3沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備方法顯色后，以不含樣品的溶液作為空白對(duì)照，于765nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，重復(fù)3次，計(jì)算加樣回收率。

1.2.2 抗菌活性研究

1.2.2.1 菌懸液的制備 將供試菌在MHA斜面培養(yǎng)基上活化，37℃培養(yǎng)12h。用接種環(huán)挑取適量菌體于0.9%的生理鹽水中，當(dāng)OD600值在0.15～0.25之間，其對(duì)應(yīng)細(xì)菌數(shù)目應(yīng)為106～108CFU/mL，即為實(shí)驗(yàn)用菌懸液。

1.2.2.2 樣品溶液的制備 精確稱(chēng)取費(fèi)菜材料50.0g，70%甲醇熱回流連續(xù)提取兩次，每次3h，過(guò)濾后合并濾液，干燥箱烘干(45～50℃)。提取物用DMSO溶解，配制成濃度為200mg/mL的樣品溶液，同時(shí)用無(wú)菌水配制濃度為0.5mg/mL的鹽酸四環(huán)素溶液作陽(yáng)性對(duì)照，過(guò)濾除菌。

1.2.2.3 抗菌活性實(shí)驗(yàn) 抑菌圈實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法測(cè)定［7］。將已滅菌的MHA培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基平板冷凝后，吸取0.1mL菌懸液滴加至平板中涂布均勻。每個(gè)培養(yǎng)皿放置3個(gè)牛津杯，每個(gè)牛津杯中加入100mg/mL的樣品溶液50μL，另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照為0.5mg/mL鹽酸四環(huán)素，陰性對(duì)照為DMSO溶液。將培養(yǎng)皿4℃固定2h后轉(zhuǎn)入37℃培養(yǎng)箱，12h后測(cè)定抑菌圈。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

最小抑菌濃度(MIC)采用96孔板法測(cè)定［8］。將MHB培養(yǎng)基與菌懸液按20∶1混勻后取100μL加入96孔板中，于第1孔中加入200mg/mL的樣品溶液100μL混勻，采用倍半稀釋法稀釋至第11孔，并從第11孔中吸取100μL棄去，第12孔作為陰性對(duì)照，不含樣品溶液。向每孔中分別加入5μL菌懸液。陽(yáng)性對(duì)照組用鹽酸四環(huán)素替代樣品溶液。將加好樣的96孔板密封后置于4℃冰箱1h后放入37℃培養(yǎng)箱，12h后觀(guān)察。以肉眼觀(guān)察，無(wú)渾濁者，即為受試菌的最小抑菌濃度(MIC)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

最小殺菌濃度(MBC)采用 96 孔板法測(cè)定［9－10］。將每個(gè) MIC前(包括 MIC)的混合液取5μL，移入100μL新鮮MHB培養(yǎng)基的96孔板中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24h后觀(guān)察，無(wú)混濁者即能殺死99.5%原始種入的細(xì)菌，為該菌的最低殺菌濃度(MBC)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 費(fèi)菜多酚含量的測(cè)定

2.1.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制結(jié)果 以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖1)，得回歸方程:y=0.1282x+0.0142，相關(guān)系數(shù) R2=0.9985，RSD(n=3)=1.58%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度在1.04～8.32μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.1.2 樣品中多酚含量測(cè)定結(jié)果 根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程，算出費(fèi)菜不同部位多酚含量。由表1可知，費(fèi)菜地上部分和地下部分多酚含量分別為45.59±0.87和96.25±0.47mg/g(以沒(méi)食子酸量/干材料表示，n=3)。

表1 費(fèi)菜多酚含量測(cè)定結(jié)果Table1 Contents of total polyphenols in Sedum aizoon L.

費(fèi)菜作為藥食兩用植物，以根或全草入藥，地上部分的莖葉亦可食用，一般地下部分在春秋季采挖，全草隨用隨采［11］;根據(jù)測(cè)定的結(jié)果，地下部分作為費(fèi)菜最重要的藥用部位，其多酚含量是地上部分的兩倍以上，但地上部分一年可多次采收，畝產(chǎn)可達(dá)8000kg，資源量較大，因此，開(kāi)展費(fèi)菜全草綜合利用研究對(duì)于費(fèi)菜工業(yè)化開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表2可知，精密度實(shí)驗(yàn)RSD為0.14%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)RSD為0.22%，表明待測(cè)樣品溶液在4h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表4可知，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD為0.15%，表明方法重復(fù)性良好。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Result of precision test

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Result of stability test

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 Result of repetitive test

2.1.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，加樣回收率實(shí)驗(yàn)RSD為0.75%，表明方法的準(zhǔn)確率較高。

2.2 抑菌活性結(jié)果與分析

費(fèi)菜提取物對(duì)8種常見(jiàn)的細(xì)菌具有一定的抑制作用，具有廣譜抗菌的效果。尤其是對(duì)于藤黃八疊球菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌，其抑菌圈大小分別為13.97±0.8、13.94±0.4、13.63±0.4和12.39±0.5mm，但對(duì)表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌均無(wú)抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.3 MIC和MBC結(jié)果與分析

費(fèi)菜提取物在較低的濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌和殺菌作用，其MIC、MBC分別為6.25、25mg/mL。對(duì)于巨大芽孢桿菌和藤黃八疊球菌，費(fèi)菜提取物有一定的抑菌效果，但殺菌作用不甚明顯。費(fèi)菜提取物對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌以及白色葡萄球菌的MIC大于或等于25mg/mL，MBC大于或等于50mg/mL，說(shuō)明對(duì)這5種菌均無(wú)明顯的殺菌抑菌作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)是引起食品污染和細(xì)菌性食物中毒的一種重要細(xì)菌，在自然界中分布廣泛，其致病力主要取決于產(chǎn)毒素和酶的能力，主要有溶血毒素、腸毒素、血漿凝固酶和耐熱核酸酶等［12］;植物多酚可以破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞通透性增加和細(xì)胞內(nèi)容物外泄，同時(shí)，通過(guò)影響細(xì)菌核酸、磷脂等細(xì)胞重要成分的合成及能量代謝，阻礙細(xì)菌蛋白正常表達(dá)，從而影響其細(xì)胞的結(jié)構(gòu)組成以及酶的催化活性，最終導(dǎo)致細(xì)菌正常生理功能的喪失［13］。由于多酚類(lèi)物質(zhì)的組成及含量差異導(dǎo)致不同植物來(lái)源的多酚提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用不同，目前，我們正在對(duì)費(fèi)菜多酚的組成及其抗菌機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，以期開(kāi)發(fā)出新的可用于工業(yè)化應(yīng)用的天然抗菌劑。

表5 多酚加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table5 Results of recoveries tests

表6 費(fèi)菜提取物的抑細(xì)菌圈直徑(mm)Table6 Diameter of inhibition zone of Sedum aizoon L.(mm)

表7 費(fèi)菜提取物對(duì)10種病原菌的MIC和MBCTable7 MICs and MBCs of Sedum aizoon L.to 10 species of pathogenic microorganisms

3 結(jié)論

3.1 植物多酚是植物主要成分之一，具有重要的生理活性，不同產(chǎn)地的氣候與生態(tài)環(huán)境以及藥用植物種質(zhì)間的基因差異均會(huì)影響其形成與積累，同一植物不同部位的多酚含量也會(huì)有所差異。本實(shí)驗(yàn)采用的福林酚試劑法作為測(cè)定多酚含量的常規(guī)方法之一，較高錳酸鉀法、酒石酸亞鐵法、普魯士蘭法等方法準(zhǔn)確度和精密度更高、穩(wěn)定性更好［14－15］，可用于有效成分的檢驗(yàn)和質(zhì)量控制。實(shí)驗(yàn)表明費(fèi)菜地上部分和地下部分多酚含量分別為45.59±0.87、96.25±0.47mg/g(以沒(méi)食子酸量/干材料表示，n=3)，多酚含量較高，尤以地下部分多酚含量最高。同時(shí)，費(fèi)菜是我國(guó)傳統(tǒng)藥材，其來(lái)源植物分布廣泛，種植栽培容易，資源量極大，可以為其工業(yè)化應(yīng)用提供良好的原料保障。

3.2 實(shí)驗(yàn)中選取了具有代表性的微生物檢測(cè)費(fèi)菜提取物的抗菌活性，結(jié)果表明費(fèi)菜提取物對(duì)多種細(xì)菌具有一定的抗菌效果，特別是對(duì)能引起細(xì)菌性食物中毒、易產(chǎn)生耐藥性的金黃色葡萄球菌抗菌效果明顯。

費(fèi)菜作為一種藥食兩用植物，其多酚含量高，抗菌活性強(qiáng)，資源量大，可廣泛用于食品、藥品以及化妝品等工業(yè)生產(chǎn)，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用的價(jià)值。

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