劉 飛，焦月華，郭文奎，于 微，谷春濤，霍貴成，*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030;2.黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)，藥物安全性評價中心，黑龍江哈爾濱 150040)

酸奶作為一種具有益生作用的乳制品，已經(jīng)普遍被消費者認可。但是由于酸奶正常發(fā)酵結(jié)束后，在產(chǎn)品貯存、運輸、銷售這一過程會發(fā)生后酸化，出現(xiàn)消費者不可接受的過酸味及感官品質(zhì)下降，影響酸奶的保質(zhì)期［1］。德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)能夠在酸奶產(chǎn)品中繼續(xù)生長，并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸導(dǎo)致酸奶發(fā)生后酸化，它具有較強的耐酸性，當外界環(huán)境中pH降低時，其質(zhì)膜 H+－ATPase(F1F0－ATPase)能通過水解ATP提供的能量將細胞內(nèi)的質(zhì)子泵出胞外，形成跨膜的pH梯度差，使細胞內(nèi)pH維持在近中性，代謝酶的活力不受影響［2］。直至環(huán)境中pH3.5時，跨膜pH梯度差才不存在，細胞內(nèi)呈酸性，新陳代謝活動開始受到抑制［3－4］。然而，理想酸奶產(chǎn)品的 pH4.2 左右。F1F0－ATPase，是由F0和F1亞基組成，其中嵌入細胞膜中的F0亞基是一個通道蛋白，具有質(zhì)子轉(zhuǎn)運活性，而當結(jié)合在細胞膜內(nèi)表面的F1亞基被從膜中釋放出來后就具有 ATPase 活性［5－6］。許多研究者發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的H+－ATPase能夠在其自身細胞內(nèi)pH的調(diào)控過程中發(fā)揮主要作用，是乳酸菌維持其細胞內(nèi)環(huán)境pH穩(wěn)定必不可少的因素。Kobayashi等首先發(fā)現(xiàn)了一株糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的突變體失去了調(diào)控其自身胞內(nèi)環(huán)境pH的能力，隨后他對這株突變菌株進行了一系列的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致突變菌株產(chǎn)生這種表型的原因是由于其胞內(nèi)的H+－ATPase的活性較低［7］。Nannen 和 Hutkins［8］分別對一株嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳亞種、干酪乳桿菌的H+－ATPase進行了研究，結(jié)果也表明H+－ATPase能夠調(diào)控細胞內(nèi)的pH，但是他們沒有在分子水平對H+－ATPase的調(diào)控機制進行深入的研究。Kullen 和 Klaenhammer［9］還 鑒 定 了 嗜 酸 乳 桿 菌(Lactobacillus acidophilus)中受pH誘導(dǎo)的F1F0－ATPase的操縱子，RT－PCR結(jié)果顯示嗜酸乳桿菌在低pH環(huán)境中生長時，不但atp基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物會增加，而且細胞膜中 F1F0－ATPase活性也會增加。Amachi等［10］的 Northern 和 Western blot分析結(jié)果卻表明，Lactococcus lactis subsp.lactis C2和由它誘變得到的H+－ATPase缺陷的突變菌株 No.1016－51的ATPase的mRNA的豐度沒有明顯差異，他們推測這可能是因為突變菌株也具有一個正常調(diào)控ATPase基因表達的系統(tǒng)，但是由于編碼ATPase的結(jié)構(gòu)基因的缺陷導(dǎo)致了突變菌株表達的ATPase的特異活性比親本的低，遺憾的是他們并沒有通過測序來驗證親本和突變菌株H+－ATPase編碼基因是否的確發(fā)生了突變。Ongol等［11］的研究也表明 H+－ATPase缺陷的突變株德氏乳桿菌保加利亞亞種SBT0164 No.55－1的H+－ATPase活性的降低是導(dǎo)致其不能夠在pH為4.5的MRS培養(yǎng)基中繼續(xù)生長的原因，但是他們并沒有利用分子生物學(xué)技術(shù)在基因水平或者轉(zhuǎn)錄水平對突變菌株的 H+－ATPase進行分析。因此，H+－ATPase缺陷的突變株對H+－ATPase活性的調(diào)控到底是由于編碼基因的突變引起的，還是菌體細胞在轉(zhuǎn)錄水平或者翻譯時進行調(diào)控還有待進一步的研究。針對這一問題，在本研究中，以通過誘變育種得到的具有弱后酸化能力的H+－ATPase缺陷的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株 KLDS 1.9201－11和親本菌株KLDS 1.9201 為研究對象［12］，分別擴增它們 H+－ATPase的編碼基因，并用DNAMAN軟件比較它們之間的相似性，為闡明乳酸菌H+－ATPase的調(diào)控機制提供理論依據(jù)，并為最終開發(fā)弱后酸化的酸奶發(fā)酵劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)KLDS 1.9201和KLDS 1.9201－11 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室菌種庫(DICC)保藏菌種;rTaq酶、dNTP、Pfu、RNase A、DNA Marker DL2000 寶生物工程有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒和溶菌酶 天根生化科技有限公司。

臺式高速離心機AnkeTGL－16C 上海安亭科學(xué)儀器廠;凝膠成像UVP 美國Thermo公司;紫外分光光度計DU－800 Beckman Coulter公司;電泳儀DYY－10C型 北京六一儀器廠;Gene Amp PCR System 9700 美國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 應(yīng)用天根公司的基因組提取試劑盒提取細菌基因組DNA，所提取的基因組DNA為后續(xù)PCR擴增實驗所用，按照試劑盒說明書操作。

1.2.2 基因組DNA的電泳鑒定 取3μL收集的基因組DNA溶液，用質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂糖進行凝膠電泳，經(jīng)EB染色，紫外燈下觀察基因組條帶的純度和完整性。

1.2.3 H+－ATPase編碼基因的 PCR擴增 查找Genebank中的德氏乳桿菌保加利亞亞種的基因組信息，發(fā)現(xiàn)德氏乳桿菌保加利亞亞種ATCC 11842的H+－transporting ATPase/ATP synthase共有8個亞基，分別為 A、B、C、alpha、beta、gamma、epsilon 和 delta，對應(yīng)的編碼基因分別為 atpB、atpF、atpE、atpA、atpD、atpG、atpC、atpH。由于其中 atpB 和 atpE、atpF 和atpH基因在基因組上相鄰。因此分別利用6個PCR反應(yīng)擴增H+－ATPase基因的全序列和H+－ATPase基因的調(diào)控序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計擴增引物，使用oligo 6.0對引物進行評估，然后由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系如下:滅菌ddH2O，37μL;10×Buffer，5μL;dNTP，4μL;基因組 DNA，1μL;上游引物，1μL;下游引物，1μL;Pfu(1U/μL)，1μL。PCR 反應(yīng)條件如下:94℃ 5min;94℃ 1min，55℃ 1min，72℃2min，共30個循環(huán);72℃ 10min;之后4℃恒溫。PCR反應(yīng)中所用的引物見表1。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的電泳鑒定 PCR擴增結(jié)束后，取5μL擴增產(chǎn)物，用質(zhì)量分數(shù)為1.5%瓊脂糖進行凝膠電泳，經(jīng)EB染色，紫外燈下觀察擴增條帶。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的測序 PCR產(chǎn)物送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化后測序。

1.2.6 H+－ATPase編碼基因的相似性比較 利用DNAMAN軟件比較親本和突變菌株的H+－ATPase各亞基編碼基因和調(diào)控基因的相似性。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因組的電泳結(jié)果

采用天根公司的細菌基因組DNA提取試劑盒提取 KLDS 1.9201和 KLDS 1.9201－11的基因組DNA，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

由圖1可知，利用試劑盒提取的KLDS 1.9201和KLDS 1.9201－11的基因組DNA的純度很高，紫外分光光度計測定結(jié)果表明OD260/OD280=1.81、OD260/OD230=2.28，因此可知提取的基因組DNA沒有RNA、蛋白和鹽類物質(zhì)的污染，可以直接用于PCR擴增H+－ATPase

表1 PCR反應(yīng)引物Table1 Primers of PCR

圖1 KLDS1.9201和KLDS1.9201－11的基因組Fig.1 Genome of KLDS1.9201 and KLDS1.9201－11

2.2 H+－ATPase編碼基因的擴增結(jié)果

以達到純度和濃度標準的KLDS 1.9201和KLDS 1.9201－11基因組DNA為模板，特異引物擴增atpA、atpD、atpG、atpC、atpB 和 atpE、atpF 和 atpH 基因，擴增結(jié)果如下。

由圖2可知，第1和泳道分別為KLDS1.9201和KLDS1.9201－11中atpB和atpE基因的PCR產(chǎn)物，條帶清晰，且無非特異性條帶出現(xiàn)。

圖2 KLDS1.9201和 KLDS1.9201－11atpB和atpE基因的PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR product of atpB and atpE in KLDS1.9201 and KLDS1.9201－11

由圖3可知，第1和2泳道分別為KLDS1.9201和KLDS1.9201－11中 atpF和 atpH基因的PCR產(chǎn)物，條帶清晰，且無非特異性條帶出現(xiàn)。

圖3 KLDS1.9201和 KLDS1.9201－11 atpF和atpH基因的PCR產(chǎn)物Fig.3 PCR product of atpF and atpH in KLDS1.9201 and KLDS1.9201－11

由圖4可知，第1和2泳道分別為KLDS1.9201和KLDS1.9201－11中atpA基因的PCR產(chǎn)物，條帶清晰，而且無非特異性條帶出現(xiàn)。

圖4 KLDS1.9201和KLDS1.9201－11atpA基因的PCR產(chǎn)物Fig.4 PCR product of atpA in KLDS1.9201 and KLDS1.9201－11

由圖5可知，第1和2泳道分別為KLDS1.9201和KLDS1.9201－11中atpG基因的PCR產(chǎn)物，條帶清晰，而且無非特異性條帶出現(xiàn)。

由圖6可知，第1和2泳道分別為KLDS1.9201和KLDS1.9201－11中atpD基因的PCR產(chǎn)物，條帶清晰，而且無非特異性條帶出現(xiàn)。

由圖7可知，第1和2泳道分別為KLDS1.9201和KLDS1.9201－11中atpC基因的PCR產(chǎn)物，條帶清晰，且無非特異性條帶出現(xiàn)。在本研究中，根據(jù)GeneBank中德氏乳桿菌保加利亞亞種ATCC11842的全基因組序列中，編碼 H+－transporting ATPase/ATP synthase的序列為模板一共設(shè)計了6對引物，使用PCR分別擴增了KLDS 1.9201和KLDS 1.9201－11的H+－transporting ATPase/ATP synthase的8個亞基A、B、C、alpha、beta、gamma、epsilon 和 delta 的編碼基因 atpB、atpF、atpE、atpA、atpD、atpG、atpC、atpH 全序列。由于本實驗需要比較親本和突變菌株 H+－transporting ATPase/ATP synthase編碼基因的相似性，因此在PCR擴增的過程中需要使用高保真的Pfu DNA聚合酶，從而將堿基錯配的誤差降低到最小程度。

圖5 KLDS1.9201和 KLDS1.9201－11中atpG基因的PCR產(chǎn)物Fig.5 PCR product of atpG in KLDS1.9201 and KLDS1.9201－11

圖6 KLDS1.9201和 KLDS1.9201－11中atpD基因的PCR產(chǎn)物Fig.6 PCR product of atpD in KLDS1.9201 and KLDS1.9201－11

2.3 親本和突變菌株H+－ATPase編碼基因的相似性比較

圖7 KLDS1.9201和KLDS1.9201－11中atpC基因的PCR產(chǎn)物Fig.7 PCR product of atpC in KLDS1.9201 and KLDS1.9201－11

利用DNAMAN軟件，對 KLDS 1.9201和 KLDS 1.9201－11的H+－ATPase編碼序列之間的相似性進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們 H+－transporting ATPase/ATP synthase的8 個亞基 A、B、C、alpha、beta、gamma、epsilon和 delta的編碼基因 atpB、atpF、atpE、atpA、atpD、atpG、atpC和atpH之間的序列相似性為100%，這說明突變菌株的 H+－transporting ATPase/ATP synthase的編碼序列并沒有發(fā)生突變，親本和突變菌株H+－ATPase活力之間的差異并不是由于它們的編碼基因發(fā)生了變化，親本和突變菌株的H+－ATPase酶蛋白的結(jié)構(gòu)是相同，而可能是由于H+－ATPase的表達量降低引起的。本研究還比較了KLDS 1.9201和德氏乳桿菌保加利亞亞種 ATCC11842的 H+－transporting ATPase/ATP synthase的編碼基因序列，結(jié)果表明atpB、atpA、atpC和atpD的相似性為100%，atpE、atpF分別有1個和2個核苷酸的差異，但是它們編碼的氨基酸沒有發(fā)生變化，atpH和atpG分別有1個和2個核苷酸的差異，而且編碼的氨基酸也發(fā)生了變化。但是總的來說H+－transporting ATPase/ATP synthase的編碼基因序列還是非常的保守，本實驗中突變菌株的H+－transporting ATPase/ATP synthase的編碼序列并沒有發(fā)生突變也進一步說明了此基因序列的高度保守性，因此，H+－ATPase缺陷菌株活力的降低并不是由于結(jié)構(gòu)基因發(fā)生了突變，極有可能是由于轉(zhuǎn)錄水平的降低引起的，需要利用更先進的熒光定量PCR技術(shù)來進行進一步的分析，從而闡明H+－ATPase的調(diào)控機制。

3 結(jié)論

同親本菌株KLDS 1.9201相比，突變菌株KLDS 1.9201－11的 H+－ATPase活性的降低并不是由于H+－ATPase編碼基因發(fā)生了突變導(dǎo)致表達的 H+－ATPase蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，從而導(dǎo)致酶活性的降低，而可能是由于H+－ATPase的表達量降低引起的，需要進行qRT－PCR檢測，因此本研究為進一步確定乳酸菌H+－ATPase的調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

［1］徐成勇，吳昊，鄭思聰，等.酸乳后酸化影響因子的初步研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(12):10－14.

［2］劉飛，焦月華，郭文奎，等.弱后酸化保加利亞乳桿菌突變菌株的遺傳穩(wěn)定性研究［J］.中國乳品工業(yè)，2012，40(9):9－12.

［3］Robert WH，Nancy LN.pH Homeostasis in Lactic Acid Bacteria［J］.Journal of Dairy Science，1993，76(8):2354－2365.

［4］Suzuki T，Ueno H，Mitome N，et al.F0 of ATP Synthase Is a Rotary Proton Channel［J］.Journal of Biology Chemistry，2002，277(15):13281－13285.

［5］Cross R L，Muller V.The Evolution of A－，F(xiàn)－，and V－type ATP Synthases and ATPases:Reversals in Function and Changes in the H+/ATP Coupling Ratio［J］.FEBS Letters，2004，576:1－4.

［6］Suzuki T，Murakami T，Iino R，et al.F1F0－ATPase/Synthase Is Geared to the Synthesis Mode by Conformational Rearrangement of ε Subunit in Response to Proton Motive Force and ADP/ATP Balance［J］.Journal of Biology Chemistry，2003，278(47):46840－46846.

［7］Kobayashi H，Suzuki T，Kinoshita N，et al.Ampification of Streptococcus faecalis Proton－Translocating ATPase by a Decrease in Cytoplasmic pH［J］.Journal of Bacteriology，1984，158(3):1157－1160.

［8］Nannen，N L and Hutkins，R W.Proton－ Translocating Adenosine Triphosphatase Activity in Lactic Acid Bacteria［J］.Journal of Dairy Science，1991，74:747－751.

［9］Kullen M J，Klaenhammer T R.Identification of the pHInducible，Proton－translocating F1F0－ATPase(atpBEFHAGDC)Operon of Lactobacillus acidophilus by Differential Display:Gene Structure，Cloning and Characterization［J］ .Molecular Microbiology，1999，33(6):1152－1161.

［10］Amachi S，Ishikawa K，Toyoda S，et al.Characterization of a Mutant of Lactococcus lactis with Reduced Membrane－bound ATPase Activity underAcidic Conditions［J］.Bioscience Biotechnology Biochemistry，1998，62(8):1574－1580.

［11］Ongol M P，Sawatari Y，Ebina Y，et al.Yoghurt Fermented by Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus H+－ ATPase－ Fefective Mutants Exhibits Enhanced Viability of Bifidobacterium breve During Storage［J］.International Journal of Microbiology，2007，116:358－366.

［12］霍貴成，崔蘭，劉飛.H+－ATPase弱化菌株的篩選及其應(yīng)激性研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，43(5):1－3.