田艷春，王秀艷

（赤峰學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

Hg2+、Cr3+對(duì)草菇菌絲生長的影響

田艷春，王秀艷

（赤峰學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

〔目的〕研究Hg2+、Cr3+單一污染對(duì)草菇菌絲生長的影響，并測定出草菇對(duì)Hg2+、Cr3+的最高耐受濃度.〔方法〕以Hg2+、Cr3+空白為對(duì)照，采用平板培養(yǎng)方法研究了Hg2+、Cr3+單一污染對(duì)草菇菌絲生長及干重的抑制影響以及草菇對(duì)Hg2+、Cr3+的最高耐受濃度.〔結(jié)果〕Hg2+、Cr3+在較高濃度條件下,對(duì)草菇菌絲生長的抑制作用非常明顯；當(dāng)Hg2+濃度在0-4mg/L范圍內(nèi)對(duì)草菇菌絲生長及干重的影響不大，當(dāng)Hg2+濃度在4-16mg/L范圍內(nèi)對(duì)草菇菌絲生長及干重的影響較為明顯；當(dāng)Cr3+濃度在0-2mg/L范圍內(nèi)對(duì)草菇菌絲生長及干重的影響不大，當(dāng)Cr3+濃度在2-16mg/L范圍內(nèi)對(duì)草菇菌絲生長及干重抑制作用非常明顯；〔結(jié)論〕一定濃度的Hg2+、Cr3+均抑制草菇菌絲生長，使其干重產(chǎn)量降低，本實(shí)驗(yàn)為土壤中Hg2+、Cr3兩種重金屬污染治理提供理論參考.

草菇；汞、鉻離子；菌落直徑；菌落（絲體）干重

草菇〔Volvariellavolvacea(Bull.exFr.)Sing.〕又名蘭花菇、美味包腳菇、中國蘑菇，在分類學(xué)上隸屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、傘菌目、光柄菇科、草菇屬.草菇菌絲生長溫度范圍為10～42℃，在適溫下生長速度極快，對(duì)金屬離子吸收能力較強(qiáng).

隨著近代工業(yè)的迅猛發(fā)展，當(dāng)前全球的環(huán)境污染問題日趨嚴(yán)重，其中環(huán)境污染中的重金屬污染已成為當(dāng)今世界備受關(guān)注的一類公害，重金屬是指比重等于或大于5.0的金屬，如Hg、Cr、Zn、Mn、Cu、Hg、Fe、Ni、As等，過量的重金屬是造成環(huán)境污染的重要因素之一，尤其是Hg2+、Cr3+的污染最為嚴(yán)重，其中Hg2+可使含巰基的酶喪失活性，失去功能；還能與酶中的氨基、二巰基、羧基、羥基以及細(xì)胞內(nèi)的磷酰基結(jié)合，引起相應(yīng)的損害；Cr3+屬低毒類，有致敏作用，引起類似哮喘的發(fā)作，對(duì)眼睛、皮膚和粘膜有刺激作用.

而近些年利用大型真菌進(jìn)行污染環(huán)境的生態(tài)修復(fù)是重金屬污染環(huán)境修復(fù)研究中一項(xiàng)新的生物技術(shù)[1-2].大型真菌在吸收必需的礦質(zhì)元素的同時(shí)，對(duì)Hg2+、Cr3+等重金屬元素具有一定的富集或生物轉(zhuǎn)化作用，從而使土壤和水體中的重金屬得到有效去除[3-4]，食用菌對(duì)重金屬污染環(huán)境的生態(tài)修復(fù)功能的前提條件是研究菌絲體和重金屬的相互作用，所以通過研究草菇菌絲對(duì)Hg2+、Cr3+污染的耐受濃度以及Hg2+、Cr3+對(duì)草菇菌絲生長的影響對(duì)環(huán)境治理和人類健康均有重要意義.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

草菇（由江蘇省江都市天達(dá)食用菌研究所提供）

1.1.2 試驗(yàn)儀器

烘干箱、電子天平、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、電熱套、打孔器、紗布、培養(yǎng)皿、小燒杯、玻璃棒、燒杯、錐形瓶、量筒.

1.1.3 試驗(yàn)培養(yǎng)基與藥品

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯煮汁20%、葡萄糖2%、瓊脂粉2%，蒸餾水1000ml

藥品：氯化汞、氯化鉻

1.2 Hg2+、Cr3+濃度設(shè)置（如表1）

表1 Hg2+、Cr3+濃度設(shè)置

1.3 試驗(yàn)方法

工藝流程：PDA斜面培養(yǎng)基的制備→試管母種的擴(kuò)大培養(yǎng)→PDA平板培養(yǎng)→添加刺激因子（Hg2+、Cr3+）的PDA平板培養(yǎng)基的制備→接種→培養(yǎng)→①觀察菌絲長勢②測定菌絲體干重和菌落直徑大小.

1.3.1 PDA斜面培養(yǎng)基的制備及檢測

清洗1000mL燒杯2個(gè)、玻璃棒2根、試管10個(gè)，烘干.選擇質(zhì)量較好的馬鈴薯（無病、未出芽、不干縮）洗凈去皮，挖去芽眼，切成長約3cm、寬約3cm、厚約3mm的薄片，稱取100g,加水500mL,煮沸至“酥而不爛”的程度，用6層紗布過濾，定容濾液，再加入瓊脂10g,用小火加熱至瓊脂徹底溶解（加瓊脂的過程中需邊加邊用玻璃棒攪拌），最后加入葡萄糖10g，沸騰使藥品全部溶解.

制備好的培養(yǎng)基趁熱分裝到試管中，一般裝入量為試管總體積的1／5～1／4.分裝時(shí)注意勿使培養(yǎng)基黏附在試管口壁上，如有黏附則應(yīng)用干凈紗布擦凈，分裝好的試管塞上松緊合適普通棉花制備的棉塞.

塞好棉塞的試管用二層報(bào)紙包扎好，以免滅菌時(shí)水蒸氣浸濕棉塞.然后豎直放入高壓鍋內(nèi)，滅菌壓力為1.47×105P a，溫度為121℃～126℃，時(shí)間30min.

滅菌后，待滅菌鍋內(nèi)的溫度降到60℃左右取出試管，然后將試管口一端墊起使試管內(nèi)的培養(yǎng)基斜面約占試管總長度的3/4.

凝固后的PDA培養(yǎng)基，在使用前應(yīng)進(jìn)行無菌檢測，將試管培養(yǎng)基置于32±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，如果3d后培養(yǎng)基表面光滑，無雜菌感染方可使用.

1.3.2 二級(jí)母種的接種及培養(yǎng)

接種前，將斜面培養(yǎng)基，接種工具，草菇母種（蓋一層報(bào)紙，以防紫外線直射引起變異），酒精燈，75%酒精棉球等放入超凈工作臺(tái)，封閉進(jìn)行紫外燈照射消毒半小時(shí)，遮光半小時(shí)，然后關(guān)閉紫外燈，打開吹風(fēng)機(jī).

首先用75%酒精棉擦拭雙手和草菇母種試管外壁，點(diǎn)燃酒精燈，灼燒接種鏟，然后用左手手掌抓住母種試管和待接種試管，母種管靠外方，用右手拆開報(bào)紙并用小拇指和小魚際、小拇指和無名指分別夾住待接種的試管和母種試管的棉塞依次拔出，邊灼燒接種鏟邊慢伸入母種試管中，待溫度降低不致灼傷菌種時(shí)，鏟出玉米粒大小的菌塊（注意不要帶太多的培養(yǎng)基），慢慢將接種鏟抽出（注意不要使菌種塊及菌種鏟碰到試管內(nèi)壁），小心伸入待接種試管培養(yǎng)基中部，菌絲朝上放好慢慢抽出接種鏟，勿碰試管內(nèi)壁，重復(fù)上述操作.

將接完種的試管放在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)30±1℃黑暗條件下培養(yǎng)7d左右，在培養(yǎng)期間應(yīng)每天觀察兩次，記錄菌絲萌發(fā)時(shí)間、定植時(shí)間，如有雜菌感染應(yīng)及時(shí)取出，避免污染其它菌種.約7～8天待菌絲長滿試管，挑選菌絲生長健壯、整齊、潔白、濃密、均勻的菌種管作為二級(jí)母種，進(jìn)行下一步試驗(yàn).

1.3.3 PDA平板培養(yǎng)基的制備及檢測

按照上述方法制備PDA培養(yǎng)基，分裝到干燥的錐形瓶中，一般裝入量為錐形瓶總體積的1/2，分裝好的錐形瓶塞上棉塞，封上兩層報(bào)紙，同時(shí)，將清洗干凈并烘干的培養(yǎng)皿用雙層報(bào)紙包好，然后與裝有培養(yǎng)基的錐形瓶一起豎直放入高壓鍋內(nèi)進(jìn)行滅菌，方法同上.

滅菌結(jié)束后取出錐形瓶，在超凈工作臺(tái)中倒平板，培養(yǎng)基的倒入量以占培養(yǎng)皿總體積的1/2為宜.

凝固后的平板培養(yǎng)基，在使用前應(yīng)進(jìn)行無菌檢測，隨機(jī)挑取3-5個(gè)平板進(jìn)行檢測，方法同上.

1.3.4 平板菌種的接種及培養(yǎng)

首先將接種所需物品在超凈工作臺(tái)中殺菌30min.

接種時(shí)用左手拿平板培養(yǎng)皿和二級(jí)母種試管，用右手小拇指和小魚際夾住母種試管的棉塞拔出，灼燒接種鏟晾涼并鏟出蠶豆大小的菌塊接入培養(yǎng)皿中央，菌絲朝上，慢慢抽出接種鏟后，勿碰培養(yǎng)皿壁，重復(fù)上述操作.將接好的培養(yǎng)皿放在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)30±1℃黑暗條件下培養(yǎng)7～8d左右，待菌絲長滿培養(yǎng)皿，挑選菌絲生長健壯、整齊、濃密、均勻的平板菌種進(jìn)行使用或保藏.

1.3.5 添加Hg2+、Cr3+的PDA平板培養(yǎng)基的制備

制備含氯化汞和氯化鉻分別為0、1、2、4、8mg的PDA培養(yǎng)基各300ml，放入高壓鍋內(nèi)滅菌3min，滅菌壓力為1.4×105P，溫度為121℃～126℃.

滅菌鍋溫度降到60℃左右，在超凈工作臺(tái)中倒平板.

凝固后的平板培養(yǎng)基，在使用前應(yīng)進(jìn)行無菌檢測，方法同上.

1.3.6 添加Hg2+、Cr3+的PDA平板培養(yǎng)基的接種與培養(yǎng)

首先將所需物品在超凈工作臺(tái)中紫外燈消毒半小時(shí)，然后用酒精棉擦拭雙手和菌種試管外壁，點(diǎn)燃酒精燈，灼燒打孔器（φ5mm），晾涼后在菌落均勻區(qū)域用打孔器（φ5mm）打取菌餅，菌絲朝上接種于平板中央，以未加測試物的基本培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)3次重復(fù)，完畢后倒置于30±1℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng).

1.3.7 菌落直徑的測定

當(dāng)對(duì)照組菌落長滿培養(yǎng)皿時(shí)培養(yǎng)結(jié)束，在菌落任一位置測量其直徑，然后逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)60°第二次測量其直徑，接著再逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)60°進(jìn)行第三次測量，3個(gè)角度測量的平均值為菌落直徑[5].

1.3.8 觀察菌絲長勢并測定菌絲體干重

將各處理的菌絲生長狀況與對(duì)照比較,對(duì)菌絲疏密程度加以描述[6].最后將培養(yǎng)皿內(nèi)加入少許水，置于帶有石棉網(wǎng)的電熱爐上加熱,待瓊脂徹底融化后,取出菌絲體,立即用80℃的去離子水沖洗3次收集菌絲.將收集的菌絲放入烘箱內(nèi)60℃烘至恒重，然后用電子秤稱其干重[4].

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的Hg2+、Cr3+對(duì)草菇菌絲長勢的影響

2.1.1 在不同濃度的Hg2+污染下草菇菌絲長勢均受到不同程度影響

由表2可見，單一Hg2+污染脅迫下,隨著Hg2+濃度的升高草菇菌絲生長速度逐漸減慢、密度逐漸減小、長勢減弱、菌絲量減少.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.

2.1.2 在不同濃度的Cr3+污染下,草菇菌絲生長均受到不同程度影響

由表3可見，單一Cr3+污染脅迫下,隨著Cr3+濃度的增大,草菇菌絲生長速度減慢、密度逐漸減小、長勢減弱.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.

表2 Hg2+污染對(duì)草菇菌絲長勢的影響

2.2 不同濃度的Hg2+、Cr3+對(duì)草菇菌落直徑的影響

表3 Cr3+污染對(duì)草菇菌絲長勢的影響

圖1 不同濃度的Hg2+對(duì)草菇菌絲長勢的影響

圖2 Cr3+污染對(duì)草菇菌絲長勢的影響

2.2.1 不同濃度的Hg2+污染對(duì)草菇菌落直徑的影響

由圖3分析可知，單一Hg2+污染脅迫下,隨著Hg2+濃度的逐漸增大,草菇菌落直徑逐漸減小.草菇菌絲在Hg2+濃度為0-16mg/L的范圍內(nèi)均抑制生長，在該濃度范圍內(nèi)隨著Hg2濃度的升高菌落直徑減小，二者呈負(fù)相關(guān).當(dāng)Hg2+濃度在0-4mg/L之間時(shí)，對(duì)菌絲生長抑制作用較弱，濃度在4-16mg/L之間時(shí)，對(duì)菌絲生長抑制作用較明顯，且在濃度為16mg/L時(shí)草菇菌落直徑最小，菌絲長勢最差，菌絲密度最稀疏，因此草菇菌絲對(duì)Hg2+的最大耐受濃度為16mg/L.

2.2.2 不同濃度的Cr3+污染對(duì)草菇菌落直徑的影響

圖3 不同濃度的Hg2+對(duì)草菇菌落直徑的影響

由圖4分析可知，單一Cr3+污染脅迫下,隨著Cr3+濃度的逐漸增大,草菇菌落直徑逐漸減小.草菇菌絲在Cr3+濃度為0-16mg/L的范圍均能生長，但在該濃度范圍內(nèi)隨著Cr3+濃度的增加菌落直徑逐漸減小，二者呈負(fù)相關(guān).當(dāng)Cr3+濃度在0-2mg/L之間時(shí)，對(duì)菌絲生長抑制作用較弱，當(dāng)Cr3+濃度在2-16mg/L之間時(shí)，對(duì)菌絲生長抑制作用最為明顯，且在濃度為16mg/L時(shí)抑制作用最強(qiáng)，草菇菌落直徑最小，菌絲長勢最差，菌絲最稀疏，因此草菇菌絲對(duì)Hg2+的最大耐受濃度為16mg/L.

圖4 不同濃度的Cr3+對(duì)草菇菌落直徑的影響

2.3 不同濃度的Hg2+、Cr3+污染對(duì)草菇菌絲體干重的影響

2.3.1 不同濃度的Hg2+污對(duì)染草菇菌絲體干重的影響

圖5 不同濃度的Hg2+對(duì)草菇菌絲體干重的影響

在不同濃度的Hg2+污染下,草菇菌絲體干重均受到不同程度影響.由圖5分析可知，單一Hg2+污染脅迫下,隨著Hg2+濃度的逐漸增大,草菇菌落干重逐漸減小.草菇菌絲在Hg2+濃度為0-16mg/L的范圍內(nèi)雖然受到不同程度的抑制，但是均能生長，在該濃度范圍內(nèi)，隨著Hg2+濃度的升高菌絲體干重逐漸降低，二者呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)Hg2+濃度在0-2mg/L之間時(shí)對(duì)干重影響較小，當(dāng)Hg2+濃度在2-16mg/L之間時(shí)對(duì)干重影響最為明顯，且在濃度為16mg/L時(shí)，菌絲體長勢最差，菌絲最稀疏，菌絲體干重最輕.

2.3.2 不同濃度的Cr3+污染對(duì)草菇菌絲體干重的影響

圖6 不同濃度的Cr3+對(duì)草菇菌絲體干重的影響

在不同濃度的Cr3+污染下,草菇菌絲體干重均受到不同程度影響，由圖6分析可知，單一Cr3+污染脅迫下隨著Cr3+濃度的逐漸增大,草菇菌絲體干重逐漸的減小.在Cr3+濃度為0-16mg/L的范圍內(nèi)雖然受到不同程度的抑制，但是均能生長，隨著Cr3+濃度的增加菌絲體干重逐漸降低，二者呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)Cr3+濃度在0-4mg/L之間時(shí)，對(duì)菌絲生長抑制作用較弱，當(dāng)Cr2+濃度在4-16mg/L之間時(shí)對(duì)干重的影響較為明顯，且在濃度為16mg/L時(shí)，菌絲體長勢最差，菌絲最稀疏，菌絲體干重最輕.

2.3.3 不同濃度的Hg2+、Cr3+污染對(duì)草菇菌絲菌落直徑的影響

圖7 不同濃度的Hg2+、Cr3+污染對(duì)草菇菌落直徑的影響

由圖7分析可知，不同濃度的Hg2+、Cr3+對(duì)菌落直徑的影響圖示趨勢基本一致.即隨著兩種重金屬濃度的增加草菇菌落直徑逐漸減小，當(dāng)二者濃度在0-2mg/L之間時(shí)，對(duì)草菇菌落直徑抑制作用較弱，當(dāng)二者濃度在2-16mg/L之間時(shí)對(duì)菌落直徑抑制作用較強(qiáng)，而且Hg2+濃度在4-16mg/L之間時(shí)抑制作用最為明顯，但二者均在Hg2+、Cr3+濃度為16mg/L時(shí)菌落直徑達(dá)到最小值.從圖中還可以看出，Hg2+對(duì)草菇菌落的生長抑制作用強(qiáng)于Cr3+.

2.3.4 不同濃度的Hg2+、Cr3+污染對(duì)草菇菌絲體干重影響的比較

由圖8分析可知，不同濃度的Hg2+、Cr3+對(duì)菌絲體干重的影響圖示趨勢基本一致.都是隨著兩種重金屬離子濃度的增加草菇菌絲體干重逐漸減小，差別在于，當(dāng)Hg 2+濃度為0-2mg/L范圍內(nèi)時(shí)對(duì)菌絲體干重抑制作用較弱，當(dāng)Hg2+濃度2-16mg/L范圍內(nèi)時(shí)抑制作用較強(qiáng)；而當(dāng)Cr3+濃度為0-4mg/L范圍內(nèi)對(duì)草菇菌絲體干重抑制作用較弱，當(dāng)Cr3+濃度為4-16mg/L范圍內(nèi)時(shí)抑制作用較強(qiáng)，但二者均在Hg2+、Cr3+濃度為16mg/L時(shí)達(dá)到最小值.

圖8 不同濃度的Hg2+、Cr3+污染對(duì)草菇菌絲體干重的影響

3 結(jié)論

3.1 在PDA平板培養(yǎng)基中加入不同濃度的Hg2+、Cr3+對(duì)草菇菌絲生長均有不同程度的抑制作用.

3.2 當(dāng)PDA平板培養(yǎng)基中Hg2+、Cr3+的濃度為16mg/L時(shí)，草菇菌絲體干重和菌落直徑均為最小值，即草菇對(duì)Hg2+、Cr3+污染的最高耐受濃度均為16mg/L.

3.3 Hg2+、Cr3+濃度在0-16mg/L范圍內(nèi)與草菇菌絲體干重和菌落直徑均呈負(fù)相關(guān)，即隨Hg2+、Cr3+濃度的升高，草菇菌絲體干重和菌落直徑均減小.

3.4 Hg2+、Cr3+濃度在0-16mg/L范圍內(nèi)，總體上看Hg2+較Cr3+對(duì)草菇菌絲體干重和菌落直徑的影響較大.

由以上分析可知，影響草菇菌絲體干重和菌落直徑的是PDA平板培養(yǎng)基中Hg2+、Cr3+的濃度大小，當(dāng)Hg2+、Cr3+的濃度在0-16mg/L之間變動(dòng)時(shí)，兩種重金屬離子的濃度與草菇菌絲體干重和菌落直徑均呈負(fù)相關(guān)，且Hg2+、Cr3+的濃度在16mg/L時(shí)菌絲體干重和菌落直徑均達(dá)到最小值，但二者的影響程度不同，而草菇對(duì)二者有一定的耐受能力，最大耐受濃度為16mg/L.

希冀此研究成果為重金屬污染環(huán)境的生態(tài)修復(fù)開辟新思路提供理論和試驗(yàn)依據(jù)，從而進(jìn)一步提高人類健康水平.

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A

1673-260 X（2013）10-0016-04