張鎖連，宋騰騰，梁 琨，陳照立

腫瘤的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種遺傳因素的改變，各類相關(guān)基因并非獨(dú)立發(fā)生作用，而是互相配合、互相調(diào)控，構(gòu)成錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，是累積性基因損傷在轉(zhuǎn)化表型方面達(dá)到頂點(diǎn)的最終結(jié)果。了解腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異，可加深對腫瘤發(fā)生、發(fā)展分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。肺癌是所有惡性腫瘤中發(fā)病率和病死率最高的腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與多種危險(xiǎn)因素有關(guān)，如環(huán)境因素、吸煙、精神因素、職業(yè)接觸史等［1］。越來越多的研究表明肺癌與多個(gè)基因表達(dá)失調(diào)有關(guān)。吸煙除了導(dǎo)致肺組織形態(tài)學(xué)改變以外，還可導(dǎo)致基因的改變［2］。筆者通過建立吸煙導(dǎo)致小鼠肺癌模型［3］，利用小鼠全基因組基因芯片篩選與吸煙所致肺癌的相關(guān)基因，再通過RT－PCR半定量和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以及Western blotting分析等技術(shù)深入研究某些(個(gè))可能與吸煙所致肺癌有關(guān)的基因在不同處理組動(dòng)物肺組織中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步確定其與肺癌的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型與分組 將200 只5 周齡健康清潔級(jí)昆明系小鼠雌雄各半隨機(jī)分為正常對照組、煙草暴露組、槲皮素干預(yù)組和維生素E 干預(yù)組，每組25 只。正常對照組動(dòng)物不加任何干預(yù)，余組均在動(dòng)式染毒柜中被動(dòng)吸煙染毒，每周染毒5 d，每天6 h，連續(xù)染毒5 個(gè)月，恢復(fù)4 個(gè)月［4］。槲皮素干預(yù)組和維生素E 干預(yù)組染毒的同時(shí)還將槲皮素［80 mg/(kg·d)］和維生素E［100 mg/(kg·d)］分別加入飼料中，連續(xù)喂養(yǎng)9 個(gè)月。全部實(shí)驗(yàn)期間，包括煙草暴露期間，小鼠均自由飲水和進(jìn)食。染毒實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠處死，手術(shù)切除全肺，放于正常光線下或解剖顯微鏡下，計(jì)數(shù)肺表面的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和形態(tài)、顏色、大小等，編號(hào)并拍照。計(jì)算腫瘤發(fā)病率和腫瘤結(jié)節(jié)發(fā)生數(shù)。選取部分肺組織用去RNA 酶處理的生理鹽水清洗后，液氮－80 ℃保存，包括正常對照組，被動(dòng)吸煙組正常組織(以下簡稱“吸煙組”)，被動(dòng)吸煙加維生素E 干預(yù)組正常組織(以下簡稱“SE 組”);被動(dòng)吸煙組腫瘤組織(以下簡稱“腫瘤組”)。以上各組樣本量均為12，雌雄各6，隨機(jī)編號(hào)為1 ～6。

1.2 主要儀器與藥品 iCycler Real time PCR 儀購自美國Bio－Rad 公司，圖像分析儀購自日本Kodak，BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，Ang－3 大鼠單抗購自美國Abcam 公司。

1.3 檢測方法 用基因芯片發(fā)現(xiàn)和分析肺癌的相關(guān)基因，最后選擇了4 條上調(diào)基因Ang－3、Arg－2、H2－Ea 和H2－D1做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn):mRNA 表達(dá)檢測。

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 小鼠Ang－3、Arg－2、H2－Ea、H2－D1 和內(nèi)參照β－actin 引物通過Primer 軟件設(shè)計(jì)，由大連寶生物公司合成。β－actin(207bp)上游引物:5'－gac agg atg cag aag gag a－3';下游引物:5'－gct gga agg tgg aca gtg ag – 3。Ang－3(110bp)上游引物:5'－gcc cag gtt ctt tgt tgt tg－3';下游引物:5'－agt tgg ctt ggc atc ata gtg－3'。Arg－2(256bp)上游引物:5'－cac ctc tca cca ctg tat c－3';下游引物:5'－aat gtc tgt tcc atc acc－3'。H2－Ea(183bp)上游引物:5'－ccc acc aaa cac cca aga ag－3';下游引物:5'－cgc cgt caa agt caa aca taa ac－3'。H2－D1 (184bp)上游引物:5'－tga aga gga gga gaa aca c－3';下游引物:5'－tga cta aag aga act gag gg－3'。

1.3.2 提取RNA 采用改良異硫氰酸胍法(Trizol試劑)提取小鼠肺組織總RNA，用紫外分光光度計(jì)分析RNA 純度和濃度。

1.3. 3 反轉(zhuǎn)錄( cDNA 合成)采用Revert Aid First Stand cDNA Synthesis kit(Fermat 公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所有操作均按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書講行。熒光實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)cDNA 經(jīng)過熒光實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增每個(gè)片斷，按照SYBR，Premix Ex Taq TM Kit (TaKaRa)說明書配制反應(yīng)體系(表1)。根據(jù)引物合成的條件摸索該基因PCR 擴(kuò)增條件，使擴(kuò)增效率基本一致:β－actin:95 ℃/10 s，95 ℃/10 s，55 ℃/20 s 共40 cycles，95 ℃/1 min，55 ℃，95 ℃，0.5 ℃/10 s 共80 個(gè)循環(huán)后繪制溶解曲線。其他基因條件基本類似，簡單如下:Ang－3:95 ℃ /10 s;95℃/10 s，54.5 ℃/20 s，共40 cycles;Arg－2:95 ℃/10 s;95 ℃/10 s，53.5 ℃/20 s，共40 cycles;H2－D1:95 ℃/10 s;95 ℃/10 s，53 ℃/20 s，共40 cycles;H2－Ea:95 ℃/10 s;95 ℃/10 s，56.5 ℃/20 s，共40 cycles。每個(gè)樣品都做3 個(gè)重復(fù)樣品管，結(jié)果去掉偏差大的值后取平均作為該樣品的最后數(shù)據(jù)值。

表1 PCR 反應(yīng)體系

1.3.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 圖像分析和相對定量定量PCR 的Ct 值表示每個(gè)PCR 反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。各模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct 值越小，反之亦然。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct 值。因此，只要獲得未知樣品的Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。本實(shí)驗(yàn)是利用樣品的Ct 值代入公式Fold Change = 2－Δ(ΔCT)，ΔCt = Cttarget－Ctβ－actin，Δ(ΔCt)= ΔCtstimulated－ΔCtcontrol，計(jì)算目的基因RNA 表達(dá)量的相對量［4］。

1.4 小鼠肺組織Ang－3 蛋白的表達(dá) 采用BCA(bicinchoninic acid)法測量提取蛋白濃度，再通過Western blotting 實(shí)驗(yàn)法測定小鼠肺組織中Ang－3蛋白表達(dá)量及其意義［5］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以±s 表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 所有小鼠對煙草暴露和抗氧化劑干預(yù)適應(yīng)良好，未因?qū)嶒?yàn)因素直接導(dǎo)致死亡。煙草暴露組小鼠肺腫瘤發(fā)病率為43.5%，每只肺表面的平均腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)為1 ± 0. 29，明顯高于對照組(11.8%，0.18 ±0.09)和維生素E 干預(yù)組(17.9%，0.32 ±0.16)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);維生素E 干預(yù)效果最好。槲皮素效果最不理想，其腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和腫瘤發(fā)病率均接近煙草暴露組。

2.2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果 熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線穩(wěn)定性和反應(yīng)特異性均較好。先對每個(gè)組內(nèi)的雌雄鼠組織中mRNA 表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)組內(nèi)雌雄比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再進(jìn)行組間比較，結(jié)果如下。

2.2.1 Ang－3 Ang－3 的mRNA 表達(dá)量在吸煙組(9.7951 ±2.9518)、SE 組(27.6338 ±15.6042)和腫瘤組(30.6544 ±15.2245)均明顯高于正常對照組(1.0469 ±0.3441)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);SE 組和腫瘤組也明顯高于吸煙組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);SE 組與腫瘤組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2 H2－Ea 腫瘤組的mRNA 表達(dá)明顯高于對照組、吸煙組和SE 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，吸煙組和SE 組相對于對照組有所增高但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，吸煙組和SE 組之間比較也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.3 Ifi203 吸煙組的mRNA 表達(dá)明顯高于對照組、SE 組和腫瘤組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);SE 組的mRNA 表達(dá)低于對照組和腫瘤組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);而腫瘤組與對照組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.4 H2－D1SE 組和腫瘤組的mRNA 表達(dá)明顯高于對照組和吸煙組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);SE 組和腫瘤組高于吸煙組(P ＜0. 05)，但SE 組和腫瘤組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.5 Arg－2 腫瘤組的mRNA 表達(dá)明顯高于對照組、吸煙組和SE 組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);吸煙組與對照組比較有所增高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;SE 組與對照組和吸煙組比較有所下降但也無統(tǒng)計(jì)意義。

2.3 Western blot 法測定各組小鼠肺組織Ang－3蛋白的結(jié)果( 圖1) Ang－3 的蛋白表達(dá)量腫瘤組(1. 5901 ± 0.1189)明顯高于對照組(0. 9054 ±0.0523)和吸煙組(1.2724 ±0.1493)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);吸煙組和SE 組(1.4282 ±0.0793)也高于對照組(P ＜0.05)，但吸煙組與SE 組之間及腫瘤組與SE 組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組小鼠肺組織Ang－3 蛋白表達(dá)

3 討論

從基因芯片檢測結(jié)果中選擇了4 條上調(diào)基因Ang－3、Arg－2、H2－Ea 和H2－D1，應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR 檢測其在吸煙所致小鼠肺癌組織中mRNA 的表達(dá)水平。對于這4 條基因的功能研究目前較少。Ang－3 是新近發(fā)現(xiàn)的Ang 家族成員之一［6］，在小鼠多種組織細(xì)胞內(nèi)都有表達(dá)，其確切功能尚不甚了解，也少見該基因與肺癌相關(guān)性的研究;H2－Ea 和Ifi203 為兩種免疫反應(yīng)類的基因，為組織化學(xué)復(fù)合物和干擾素類的物質(zhì);H2－Ea 僅見于1995 年的一篇相關(guān)報(bào)道，而基因Ifi203 的研究，局限于對其的細(xì)胞調(diào)控功能的研究，有關(guān)與肺癌的關(guān)系研究目前還未見報(bào)道;Arg－2 主要在腎和腦中發(fā)現(xiàn)，肝外Arg－2 轉(zhuǎn)化活性還未被提及，有人提出它參與多肽、氨基酸和神經(jīng)遞質(zhì)的合成即在巨噬細(xì)胞中與一氧化氮合酶競爭，但是它的作用還很少被明確［7］;H2－D1基因的相關(guān)文章尚未查找到。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4 個(gè)基因Ang－3、Arg－2、H2－Ea 和H2－D1在肺癌組織中表達(dá)明顯高于正常組織，結(jié)果表明這4 個(gè)基因可能作為肺腫瘤中癌基因的新候選基因或者作為促進(jìn)腫瘤發(fā)生的新基因。本實(shí)驗(yàn)又重點(diǎn)選擇Ang－3 進(jìn)一步做western blot 檢測分析其蛋白表達(dá)及其意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ang－3的蛋白表達(dá)量腫瘤組明顯高于對照組和吸煙組，吸煙組和SE 組也高于對照組，但吸煙組與SE 組之間無差別，這與PCR 結(jié)果幾乎完全一致，表明Ang－3基因在吸煙所致小鼠肺癌組織中高表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)吸煙有促進(jìn)Ang－3 表達(dá)的作用，而維生素E 并未抑制該作用。Ang－3 是Ang 家族的成員之一，目前，Ang 家族主要包括Ang－1、Ang－2、Ang－3、Ang－4 四種分子［6］。Ang 是新近發(fā)現(xiàn)的唯一含有受體激動(dòng)劑和受體抑制劑的血管生長因子家族，它們的結(jié)構(gòu)基本相同，都是由信號(hào)肽、N－端區(qū)域、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和類纖維蛋白原結(jié)構(gòu)域等部分組成，Ang與它們的共同受體Tie－2 結(jié)合后而產(chǎn)生不同的作用。

目前，有關(guān)Ang 與肺癌的研究還很少。有研究證實(shí)，在肺癌實(shí)體及癌周組織中均存在Ang－1 的低表達(dá)，Ang－1 可能是通過發(fā)揮促進(jìn)正常血管成熟和穩(wěn)定而達(dá)到抑制腫瘤血管的作用［8］。這與文獻(xiàn)［9］提到的Ang－1 在正常肺組織中或者在肺癌組織中高表達(dá)都有較好的預(yù)后結(jié)論基本吻合。在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)有Ang－2 高表達(dá)［10］。大多數(shù)報(bào)道表明，Ang－2 基因在肺癌尤其是非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)［11，12］。Ang－2 在肺癌各期患者血清中均有較高表達(dá)，對肺癌的早期發(fā)現(xiàn)有一定作用，血清Ang－2表達(dá)水平與腫瘤轉(zhuǎn)移、分期有關(guān)，對肺癌臨床分期有幫助［13］。目前只觀察到Ang－3 在人肺和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中表達(dá)，并受血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的調(diào)控。Motoi 等［14］研究顯示:經(jīng)VEGF 可上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的Ang－3 表達(dá)，并下調(diào)Ang－2 表達(dá)。Xu 等［15］證實(shí)與Ang－1、Ang－2 不同，Ang－3是通過硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)尤其是基底膜蛋白多糖系縛于細(xì)胞表面。結(jié)合了Ang－3 的細(xì)胞表面容易與受體Tie－2 結(jié)合;HSPGs 可能增強(qiáng)或調(diào)節(jié)Ang－3 的生物活性，也有可能是HSPGs 使Ang－3 集中在細(xì)胞表面并使Ang－3 暴露于其受體以引起特異的局部反應(yīng)。誘導(dǎo)突變試驗(yàn)揭示，Ang－3 的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域與其結(jié)合于細(xì)胞表面有重要關(guān)系。還有人證實(shí)Ang－2 和Ang－3 與Ang－1 競爭結(jié)合Tie－2 并阻礙Ang－1 引起的Tie－2 磷酸化［16］。但Ang－3 如何影響內(nèi)皮細(xì)胞行為以及如何調(diào)節(jié)其生物活性有待于進(jìn)一步證實(shí)。Ang－3 的生物學(xué)功能還不十分明了，其與肺癌的關(guān)系更是罕見報(bào)道。Xu 等［17］最近發(fā)現(xiàn)Ang－3 抑制內(nèi)皮細(xì)胞的再生及存活并能通過與Ang－1 競爭性結(jié)合Tie－2來阻礙Ang－1－和VEGF－誘導(dǎo)的Erk1/2 和Akt激酶活性。Ang－3 的過量表達(dá)通過抑制腫瘤血管生成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡來抑制Lewis 肺癌和乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。盡管這提示Ang－3 可能抑制癌轉(zhuǎn)移，但并不能解釋Ang－3 與肺癌的關(guān)系。Thijssen等［18］將卵巢癌細(xì)胞種植到裸鼠體內(nèi)從而得到種植瘤，通過檢測后，發(fā)現(xiàn)Ang－3 在非腫瘤細(xì)胞內(nèi)是上調(diào)的。本實(shí)驗(yàn)首次證明了吸煙能夠促進(jìn)Ang－3 mRNA 及蛋白的表達(dá)，并且在吸煙所致肺癌組織中是過表達(dá)的。

本次實(shí)驗(yàn)，筆者通過基因芯片技術(shù)檢測出小鼠全基因組表達(dá)譜，再通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR 及western blotting 證實(shí)吸煙能明顯導(dǎo)致Ang－3 mRNA及蛋白的高表達(dá)，并且，Ang－3 在腫瘤組織中表達(dá)最高，表明Ang－3 在吸煙所致小鼠肺癌的發(fā)生過程中是活躍因素，起了一定的促進(jìn)作用。腫瘤持續(xù)性生長和轉(zhuǎn)移需要新生血管的形成。在腫瘤新生血管形成的影響因素中，最有效和特異的因子就是VEGF，VEGF 通過促進(jìn)新生血管的形成加速了非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移［19］。那么，Ang－3 作為血管生長因子家族之一，其與吸煙以及Ang－3 與肺癌的關(guān)系如何尚需要臨床實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步檢測證實(shí)。如果，Ang－3 在人肺癌中顯示高表達(dá)，那么Ang－3將與Ang－1、Ang－2 一樣將成為指示肺癌預(yù)后的影響因子。

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