孫玉紅 章卓 李曉冰 王璐璐 肖順漢

（瀘州醫(yī)學院藥學院藥理教研室，四川 瀘州646000）

血管內(nèi)膜的完整性是機體維持循環(huán)系統(tǒng)和組織器官局部內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素之一。多種因素如應(yīng)激反應(yīng)、心腦血管病、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等引起內(nèi)皮損傷后，會引發(fā)或促進多種疾病的發(fā)生發(fā)展［1］。脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是革蘭陰性菌細胞壁主要成分，可導(dǎo)致血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)，進而造成血管內(nèi)皮細胞損傷，是心腦血管疾病、糖尿病等疾病發(fā)生發(fā)展的主要病理因素和炎癥反應(yīng)過程的早期事件［2］。

白藜蘆醇（Resveratro1，Res）是從多年生草本植物蓼科蓼屬虎杖的根莖中提取的單體，分子式C14H12O3，研究顯示，白藜蘆醇對炎癥有一定治療作用［3］，但白藜蘆醇對脂多糖損傷血管內(nèi)皮有無保護效應(yīng)目前尚不清楚，本課題通過觀察白藜蘆醇對LPS刺激人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVEC）后細胞活力影響并觀察對相應(yīng)炎癥因子的影響，探討白藜蘆醇對血管內(nèi)皮的保護效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑

白藜蘆醇（純度98%，白色粉末，購自陜西森弗生物技術(shù)公司）；LPS（L2880，美國 Sigma公司，）；人IL－6、PGE2ELISA 檢測試劑盒（Cayman化學公司）；低內(nèi)毒素胎牛血清（杭州四季青公司）。

1.1.2 儀器

超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW－CJ－1F型）；酶標分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司，DNM－9602型）；CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司，MCO－15AC型）；倒置相差顯微鏡（日本O－lympus公司，CKX41型）。

1.2 方法

1.2.1 白藜蘆醇對HUVEC細胞和LPS刺激后 HUVEC細胞活力影響（CCK－8法）

HUVEC細胞使用含10%的胎牛血清、100U·ml－1青霉素、鏈霉素的RMPI－1640培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中生長。調(diào)整細胞懸液濃度為5×104·ml－1，加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200μl，將96孔板分為空白（培養(yǎng)基）、陰性對照（細胞＋培養(yǎng)基）、白藜蘆醇1、5、10、50、100μmol·L－1組（細胞＋培養(yǎng)基＋藥物）、LPS模型組（細胞＋培養(yǎng)基＋LPS，LPS終濃度0.1μg·ml－1）、白藜蘆醇1、5、10、50、100μmol·L－1＋脂多糖干預(yù)組（細胞＋LPS＋培養(yǎng)基＋藥物，LPS終濃度0.1μg·ml－1），每組均設(shè)3復(fù)孔。白藜蘆醇在細胞置孵箱培養(yǎng)2h后共培養(yǎng)。采用CCK－8法，波長450nm處測定相應(yīng)的吸光度（Absorbent，A）值，以吸光度值比較細胞活力情況。

1.2.2 白藜蘆醇對LPS刺激后 HUVEC細胞分泌IL－6、PGE2的影響

調(diào)整細胞懸液濃度為1×106·ml－1，選擇12孔板培養(yǎng)，置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)12h，將12孔板分為陰性對照組（細胞＋培養(yǎng)基）、LPS模型組（細胞＋培養(yǎng)基＋LPS，LPS終濃度0.1μg·ml－1）、白藜蘆醇1、5、10、50、100μmol·L－1＋脂多糖干預(yù)組（細胞＋LPS＋培養(yǎng)基＋藥物，LPS終濃度0.1μg·ml－1），每組均設(shè)3復(fù)孔，處理后繼續(xù)培養(yǎng)12h，每孔取200μl上清液，采取酶標法測定IL－6、PGE2。IL－6、PGE2的測定按試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對HUVEC細胞和LPS刺激后HUVEC細胞活力的影響

與陰性對照組比較，不同濃度白藜蘆醇對正常HUVEC細胞活力并無影響（P＞0.05）。但給予0.1μg·ml－1LPS干預(yù)后，細胞活力明顯下降（P＜0.05）。與LPS組相比，白藜蘆醇各劑量組對HUVEC細胞活力均有明顯提高（P＜0.05），見表1。

表1 白藜蘆醇對HUVEC細胞和LPS刺激后HUVEC細胞活力的影響（±s）

表1 白藜蘆醇對HUVEC細胞和LPS刺激后HUVEC細胞活力的影響（±s）

注：與模型組相比，＊P＜0.05；與陰性對照組相比，＃P＜0.05

組 別 濃 度 LPS未刺激（－） LPS刺激（＋）0.11±0.01 0.09±0.01陰性對照組 － 0.47±0.01 0.44±0.05 LPS組 0.1μg·ml－1 － 0.24±0.01＃白藜蘆醇組 1μmol·L－1 0.42±0.01 0.32±0.01白藜蘆醇組 5μmol·L－1 0.43±0.02 0.38±0.02＊白藜蘆醇組 10μmol·L－1 0.42±0.02 0.39±0.02＊白藜蘆醇組 50μmol·L－1 0.43±0.01 0.40±0.01＊白藜蘆醇組 100μmol·L－1 0.44±0.01 0.41±0.02空白組 －＊

2.2 白藜蘆醇對LPS刺激后HUVEC細胞分泌IL－6、PGE2的影響

正常 HUVEC細胞上清PGE2、IL－6含量較低，分別為579.3±5.6pg· ml－1和 61.8±6.1pg· ml－1。 給 予0.1μg·ml－1的LPS刺激后，PGE2、IL－6含量均顯著增加，分別達4778.8±271.2pg·ml－1和1366.4±107.5pg·ml－1，同陰性對照組比較有顯著差異（P＜0.05）。給予不同劑量白藜蘆醇處理后細胞分泌PGE2、IL－6不同程度的減少，有一定的劑量依賴性，同模型組比較有顯著差異（P＜0.05），見表2。

表2 白藜蘆醇對LPS刺激后HUVEC細胞分泌IL－6、PGE2的影響（±s）

表2 白藜蘆醇對LPS刺激后HUVEC細胞分泌IL－6、PGE2的影響（±s）

注：與模型組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與陰性對照組相比，＃＃P＜0.01

組 別 濃 度 PGE2（pg·ml－1） IL－6（pg·ml－1）－ 579.3±5.6 61.8±6.1 LPS組 0.1μg·ml－1 4778.8±271.2＃＃ 1366.4±107.5＃＃白藜蘆醇＋LPS組 1μmol·L－1 3789.2±112.5 1050.2±95.2白藜蘆醇＋LPS組 5μmol·L－1 2792.3±61.4＊ 850.6±87.2＊白藜蘆醇＋LPS組 10μmol·L－1 2492.3±121.5＊＊ 642.6±67.4＊＊白藜蘆醇＋LPS組 50μmol·L－1 2297.2±137.5＊＊ 450.7±64.2＊＊白藜蘆醇＋LPS組 100μmol·L－1 2143.2±137.1＊＊ 478.4±31.1陰性對照組＊＊

3 討論

白藜蘆醇為天然提取物，無色針狀晶體，難溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮等極性較強的溶劑。白藜蘆醇具有抗腫瘤、保護心血管、抗炎和神經(jīng)保護作用等多種藥理學效應(yīng)［3－5］。本實驗經(jīng)過預(yù)試將白藜蘆醇溶于無水乙醇（最終細胞內(nèi)濃度小于0.1%）中，使其即可達到助溶，又不會對細胞因子的釋放產(chǎn)生影響。

目前認為，血管內(nèi)皮細胞的完整對于機體維持循環(huán)系統(tǒng)和組織器官局部內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定非常重要。但在炎癥反應(yīng)中，尤其是LPS刺激可以引起內(nèi)皮損傷后，進而造成血管內(nèi)皮細胞損傷，是心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要病理因素。目前越來越多的研究顯示白藜蘆醇是心血管保護作用的主要功能因子。體外試驗證實白藜蘆醇可以抑制血小板功能和內(nèi)皮細胞TF的表達，從而減少血栓形成［6］。體外試驗還證實白藜蘆醇由于抑制了類花生酸的合成和血小板鈣通道，從而抑制了由血栓素、ADP和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集［7］。IL－6、PGE2是參與炎癥反應(yīng)的兩種最重要的因子，在炎癥過程中發(fā)揮重要的作用［8－10］，因此本實驗選擇這兩個因子作為指標觀察白藜蘆醇對LPS刺激HUVEC的影響。

為了排除白藜蘆醇本身是否具有細胞毒性以及對細胞因子作用與細胞毒有關(guān)，本研究檢測了白藜蘆醇對HUVEC細胞活力的影響，比較在LPS未刺激和刺激情況下的差異。結(jié)果顯示不同濃度白藜蘆醇對正常HUVEC細胞活力并無影響，但可明顯提高LPS刺激后HUVEC細胞活力。另外模型組細胞培養(yǎng)上清IL－6、PGE2檢測結(jié)果明顯高于正常組，而白藜蘆醇各干預(yù)組可以明顯降低IL－6、PGE2表達，因此，我們認為白藜蘆醇可以保護HUVEC細胞，提高對LPS刺激的耐受能力，此作用可能與抑制炎細胞因子TNF－α和IL－6的釋放有關(guān)，并非白藜蘆醇細胞毒作用所致，這為白藜蘆醇用于心血管疾病以及糖尿病大血管病變等疾病的治療提供了理論依據(jù)。白藜蘆醇是否干預(yù)其他炎癥因子或其他途徑保護血管內(nèi)皮作用尚有待進一步實驗證實。

1 Liu D，Zhang D，Scafidi J，et al.C1inhibitor prevents gram－negative bacterial lipopolysaccharide－induced vascular permeability［J］.Blood，2005，105（6）：2350－2355.

2 郝鈺，趙斌，郭鈺琪，等.脂多糖誘導(dǎo)小鼠內(nèi)皮損傷早期T細胞亞群的變化［J］.中國免疫學雜志，2011，27（6）：488－452.

3 孟雪蓮，楊靜玉，吳春福.白藜蘆醇的藥理學作用研究進展［J］.沈陽藥科大學學報，2008，25（S）：51－54.

4 Mikua－Pietrasik J，Kuczmarska A，Kucińska M，et al.Resveratrol and its synthetic derivatives exert opposite effects on mesothelial cell－dependent angiogenesis via modulating secretion of VEGF and IL－8／CXCL8［J］.Angiogenesis，2012，15（3）：361－376.

5 Zong Y，Sun L，Liu B，et al.Resveratrol inhibits LPS－induced MAPKs activation via activation of the phosphatidylinositol 3－kinase pathway in murine RAW 264.7macrophage cells［J］.PloS One，2012，7（8）：e44107－e44120.

6 Pendurthi UR，Rao LV.Resveratrol suppresses agonist－induced monocyte adhesion to cultured human endothelial cells［J］.Thromb Res，2002，106（4－5）：243－248.

7 Dobrydneva Y，Williams RL，Morris GZ，et al.Dietary phytoestrogens and their synthetic structural analogues as calcium channel blockers in human platelets［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2002，40（3）：399－410.

8 Houser KR，Johnson DK，Ishmael FT.Anti－inflammatory effects of methoxyphenolic compounds on human airway cells［J］.J Inflamm（Lond），2012，9（6）：1－12.

9 Hashizume M，Hayakawa N，Suzuki M，et al.IL－6／sIL－6Rtranssignalling，but not TNF－alpha induced angiogenesis in a HUVEC and synovial cell co－culture system［J］.Rheumatol Int，2009，29（12）：1449－1454.

10 劉佳，尚文斌.白藜蘆醇治療2型糖尿病及其相關(guān)疾病作用的分子機制研究進展［J］.南京中醫(yī)藥大學學報，2010，26（2）：158－160.