許崇輝 潘芳 溫巧玲 劉慧智 程樹軍 李妙珍

(廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東廣州 510623)

1 前言

戊二醛是一種具有揮發(fā)性和刺激性的化學(xué)試劑，主要用于皮革鞣制和作為殺菌劑［1］。在其生產(chǎn)使用過程中，可經(jīng)皮膚(粘膜)、經(jīng)呼吸道和經(jīng)口3個(gè)途徑進(jìn)入人體而造成機(jī)體危害。急性毒性實(shí)驗(yàn)表明［2］，戊二醛小鼠經(jīng)口 LD50為 248 mg/kgbw，大鼠經(jīng)口LD50為239 mg/kgbw，經(jīng)皮 LD50≥2000mg/kgbw，急性吸入毒性4h－LC50為768mg/m3，按急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)屬于中低毒性物質(zhì)。在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)和使用過程中，戊二醛的生產(chǎn)者和使用者暴露接觸的特點(diǎn)是：暴露接觸濃度不高，急性中毒風(fēng)險(xiǎn)較小，但進(jìn)入機(jī)體的途徑多、暴露接觸時(shí)間長(zhǎng)而可能存在化學(xué)物質(zhì)的遺傳毒性損害。

為了了解戊二醛對(duì)生產(chǎn)者和使用者遺傳毒性的危害程度，本研究對(duì)某品牌25%戊二醛溶液進(jìn)行了Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)的遺傳毒性試驗(yàn)?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)檢測(cè)情況報(bào)告如下。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株、動(dòng)物

菌株及S9：鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型突變型菌株 TA97、TA98、TA100、TA102 和 S9，由廣州市疾控中心提供;

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)昆明種小鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(粵)2008－0002;微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：NO.0064739。試驗(yàn)前在動(dòng)物房適應(yīng)5d。

實(shí)驗(yàn)環(huán)境：SPF級(jí)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK(粵)2008－0086。實(shí)驗(yàn)期間，室溫21±2℃，相對(duì)濕度52% －65%。

2.1.2 儀器

低溫高速離心機(jī)，低溫冰箱，恒溫培養(yǎng)箱，潔凈工作臺(tái)，生物顯微鏡，電子天平，解培器械等。

2.1.3 主要試劑

試驗(yàn)樣品：市售戊二醛溶液(汕頭市西隴化工廠有限公司生產(chǎn)，濃度為25%，分析純);絲裂霉素、1.8－二羥蒽醌：武漢馳飛精細(xì)化學(xué)科技發(fā)展有限公司;2－氨基芴：上海金穗生物科技有限公司;疊氮鈉：上海天齊生物科技有限公司;地可松(Deon4－dimethylaminobenzenediazosulfonic*acid sodium：蘇州亞科化學(xué)試劑股份有限公司;環(huán)磷酰胺：山西普德藥業(yè)有限公司;Wright－Giemsa染液：珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

2.2 方法

2.2.1 試驗(yàn)溶液配制

Ames試驗(yàn)：在無菌操作條件下，試驗(yàn)樣品用蒸餾水稀釋配制成戊二醛含量為20mg/mL溶液作為最高劑量組(即2000μg/皿)，其他劑量組分別以此為母液進(jìn)行稀釋;小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)的高劑量組分別為125mg/kgbw(約相當(dāng)于1/2的經(jīng)口LD50的劑量)和83mg/kg體重(約相當(dāng)于1/3的經(jīng)口LD50的劑量)。其他劑量組分別用高劑量組稀釋而成。

2.2.2 Ames試驗(yàn)［3］

采用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型 TA97、TA98、TA100、TA102 四株試驗(yàn)菌株進(jìn)行試驗(yàn)。設(shè)2000、400、80、16μg/皿 4 個(gè)劑量組和陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組。采用平板摻入法，加S9與不加S9進(jìn)行試驗(yàn)，菌株性狀及S9活性經(jīng)鑒定符合要求。37℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)每皿菌落數(shù)，如受試物的回變菌落數(shù)超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍以上，并有劑量－反應(yīng)關(guān)系者定為陽性。整個(gè)實(shí)驗(yàn)在相同試驗(yàn)條件下進(jìn)行2次獨(dú)立試驗(yàn)。

2.2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)［4］

取體重25－30 g SPF級(jí)昆明種小鼠50只，隨機(jī)分為高劑量組、中劑量組、低劑量組、陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組，每組10只，雌雄各半。用蒸餾水作為陰性對(duì)照組受試物;陽性對(duì)照組給予環(huán)磷酰胺，劑量為40mg/kgbw。試驗(yàn)組高、中、低3個(gè)劑量組的劑量分別為125、50、5mg/kgbw;采用30h給受試物法，經(jīng)口灌胃方式 2次，染毒間隔 24h，每次按0.2mL/10g體重的量給予。在第2次染毒后6h，處死各組動(dòng)物。每個(gè)小鼠取2根股骨，用小牛血清常規(guī)涂片，晾干后，在無水甲醇液中固定8min，第2天在Wright－Giemsa染液中染4min。在油鏡下閱片，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，計(jì)算微核發(fā)生率;計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比例(PCE/NCE)。

2.2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)［5］

SPF級(jí)昆明種雄性小鼠30只，體重25－30g，隨機(jī)分為5組，每組6只。陽性對(duì)照組給予50mg/kgbw劑量的環(huán)磷酰胺;陰性對(duì)照組給予蒸餾水。3個(gè)試驗(yàn)組給樣劑量分別為83、13、1.3mg/kgbw。按每只每天0.2mL/10g體重的量經(jīng)口給予，連續(xù)5 d，各組動(dòng)物正常飼養(yǎng)30 d。在首次灌胃后的第35天處死動(dòng)物。取出二側(cè)副睪，放入有適量(約0.5mL)生理鹽水的小燒杯中。用眼科剪將副睪縱向剪1－2刀，靜止約4 min，輕輕搖動(dòng)。吸液涂片?？諝飧稍锖?，用甲醇固定約7 min，干燥，用1.5%伊紅染色1 h，用水輕沖，干燥。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子，計(jì)算畸變精子發(fā)生率。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 Ames試驗(yàn)

在細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中，最高濃度應(yīng)能顯示明顯的毒性，見回復(fù)突變數(shù)減少、背景菌斑減少或消失。對(duì) TA97、TA98、TA100、TA102四株試驗(yàn)菌株，加與不加S9，樣品各劑量組回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，亦無劑量—反應(yīng)關(guān)系。2次獨(dú)立試驗(yàn)的結(jié)果見表1、表2。

表1 第1次鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)結(jié)果()

表1 第1次鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)結(jié)果()

TA97TA98TA100TA102－S9 +S9受試物組 2000 124.32.1 120.33.2 37.01.0 34.01.0 128.0組別 劑 量(μg/皿)－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S93.6 129.04.4 260.32.5 260.32.5400 119.73.1 125.75.5 35.72.1 37.02.6 127.73.5 128.02.0 256.32.5 256.32.580 122.33.1 126.02.0 37.04.6 32.32.3 126.72.1 127.34.9 261.03.0 261.03.0

(續(xù)表)

表2 第2次鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)結(jié)果()

表2 第2次鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)結(jié)果()

TA97TA98TA100TA102－S9 +S9受試物組 2000 124.72.4 124.62.6 37.02.1 37.03.8 128.3組別 劑 量(μg/皿)－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S92.5 125.35.9 258.03.8 256.33.3400 126.74.7 127.35.4 36.32.5 35.42.6 126.74.3 128.33.8 263.03.4 25.33.880 129.72.5 124.02.3 36.72.3 35.32.8 128.92.6 128.03.5 25842.5 258.03.516 122.32.6 124.34.3 36.43.2 36.32.3 126.32.7 126.33.2 260.4.6 257.35.2陰性對(duì)照 － 128.33.9 126.32.5 34.42.3 34.32.8 127.02.6 134.83.2 2787.6 263.03.3陽性對(duì)照 見注 1238164 1296306 2349363 1363216 1497228 1793301 1260156 1257156

3.2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

一般癥狀：灌胃約30min后，高劑量組受試動(dòng)物出現(xiàn)以下中毒癥狀：呆滯、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、豎毛、皮膚略紫紺、肢體癱軟、呼吸困難等，但至處死動(dòng)物前，各組動(dòng)物未見死亡。

鏡檢：在高劑量組鏡檢可見細(xì)胞溶解、破裂現(xiàn)象;樣品各劑量組微核率與陰性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而各劑量組和陰性對(duì)照組微核率顯著低于環(huán)磷酰胺組(P＜0.01)，各組PCE/NCE比值均在正常范圍內(nèi)，見表3。

表3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率和PCE/NCE比值

3.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

一般癥狀：在給予受試物期間，高劑量組和陽性對(duì)照組受試動(dòng)物可見以下中毒癥狀：呆滯、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、豎毛、皮膚略紫紺、肢體癱軟等癥狀，停止染毒后1－2d逐漸恢復(fù)。在實(shí)驗(yàn)的第35天處死動(dòng)物前，各組動(dòng)物均未見死亡和中毒癥狀，生長(zhǎng)發(fā)育狀況和體重?zé)o明顯區(qū)別。

精子鏡檢：陽性對(duì)照組畸變率明顯高于陰性對(duì)照組和高、中、低劑量組，存在倍量差異，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);受試物高、中、低劑量組畸變率分別與陰性對(duì)照組相比無顯著性差異，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);見表4。

表4 對(duì)小鼠精子畸形發(fā)生率的影響

4 討論

Ames試驗(yàn)、微核試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)是經(jīng)典、常用的檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)遺傳毒性的方法組合［6］。Ames試驗(yàn)是應(yīng)用最廣的基因突變檢測(cè)方法，鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98檢測(cè)移碼突變、TA100、TA102菌株檢測(cè)堿基置換和移碼突變，反映基因水平上的遺傳物質(zhì)受損情況。微核試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)反映了體細(xì)胞染色體遺傳物質(zhì)受損情況和生殖細(xì)胞受損情況。以上3項(xiàng)試驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè)，可從體內(nèi)、體外試驗(yàn)兩方面，全面檢測(cè)外來物質(zhì)對(duì)原核細(xì)胞和真核細(xì)胞、生殖細(xì)胞與體細(xì)胞的遺傳毒性。分別反映了受檢化學(xué)物質(zhì)對(duì)基因、染色體和生殖細(xì)胞的致突變性。

在本實(shí)驗(yàn)中，戊二醛作為一種具有揮發(fā)性和刺激性的化學(xué)試劑，在其生產(chǎn)使用過程中可多途徑、低劑量進(jìn)入人體，Ames試驗(yàn)、微核試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)的最高劑量分別是 2000μg/皿、125mg/kg體重、83mg/kg體重，可見到抑菌現(xiàn)象或中毒癥狀，說明3個(gè)實(shí)驗(yàn)的高劑量組的染毒劑量足夠大。而在此較高劑量水平下，Ames試驗(yàn)、微核試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)的高、中、低劑量組結(jié)果均為陰性，說明戊二醛沒有遺傳毒性。

［1］李臨生，張京東，張昌輝.戊二醛消毒劑的特點(diǎn)與應(yīng)用［J］.日用化學(xué)工業(yè)，2004，34(6)：385－389.

［2］許崇輝，潘芳，溫巧玲，等.戊二醛急性毒性研究［J］.檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2012，22(4)：22 －24.

［3］GB/T 21786－2008化學(xué)品 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)方法［S］.

［4］GB/T 21773－2008化學(xué)品體內(nèi)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)方法［S］.

［5］GB15193.7－2003小鼠精子畸形試驗(yàn)［S］.

［6］FDA.Guidance for industy and review staff：Recommended approaches to integration of genetic toxicology study results［S］.2006.