張學(xué)慧

(赤峰工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

刺槐素是一種天然黃酮化合物，通常存在于刺槐花、杭白菊及野菊花等植物中，具有抗氧化、抑菌及促進(jìn)白血球吞噬等生物作用[1–2]，具有類似于維生素P 的功效，能解除平滑肌痙攣，降低皮膚、血管的通透性，抑制醛糖還原酶活性，從而減輕炎性病變[3]。NO 是一種信使分子，其主要機(jī)制是激活生物體內(nèi)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，升高細(xì)胞內(nèi)環(huán)鳥苷酸水平，從而產(chǎn)生各種生物活性。在胃腸道系統(tǒng)中，NO 發(fā)揮著與前列腺素(PGs)類似的作用，能抑制胃酸分泌，調(diào)節(jié)黏膜血流量，促進(jìn)黏液分泌，調(diào)節(jié)生長因子及抑制白細(xì)胞的粘附，從而對胃腸粘膜起到保護(hù)作用[4–5]。NO 供體型非甾體抗炎化合物(NO–NSAIDs)是由阿司匹林、雙氯芬酸等藥物與外源性NO 供體(硝酸酯、亞硝酸酯等)通過中間鏈偶聯(lián)得到的。這類化合物既保留了NSAIDs 的鎮(zhèn)痛、抗炎作用，又具有NO 介導(dǎo)的胃腸道和心血管保護(hù)作用[6]。在這些研究的基礎(chǔ)上，筆者以香葉木素為原料，通過多步反應(yīng)，合成有機(jī)硝酸酯類NO 供體型刺槐素衍生物，并進(jìn)行體外NO 釋放測試，以確證其能否釋放一定量的NO。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：Bruker–AVANCE500 核磁共振測試儀；美國Finnigan 液–質(zhì)聯(lián)用儀；X–4 數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測定儀；ZF7 三用紫外分析儀。

主要試劑：香葉木素由陜西慈緣生物技術(shù)有限公司提供；DMF、氯芐、二氯甲烷、甲醇、四氫呋喃、丙酮等試劑均為分析純或化學(xué)純；無水溶劑通過4A 分子篩干燥后重蒸獲得。

1.2 方 法

1.2.1 化合物O7-苯基香葉木素(2)的合成

參照文獻(xiàn)[7–8]中的方法，在N2保護(hù)下，向香葉木素(3 g，10 mmol)的KHCO3(1.1 g，11 mmol)DMF (50 mL)溶液中加入氯芐(1.38 mL，12 mmol)，接著在125 °C下繼續(xù)攪拌2.5 h后停止反應(yīng)。冷卻、過濾、濃縮，得到的固體，通過硅膠柱層析(二氯甲烷與甲醇的體積比為99︰1)分離純化，得到黃色晶體2(2.46 g，收率63%)。1H NMR (d6–DMSO) δ (ppm) : 3.85 (s,3H,OCH3–4′),5.22 (s,2H,CH2of the benzylgroup) ，6.43 (s,1H,H–6)，6.77 (s,1H,H–3),6.83 (s,1H,H–8),7.07 (d,1H,J = 8.5 Hz,H–5′)，7.31–7.46 (m,6H,5H of the benzyl group and H–2′)，7.53 (d,1H，J= 8.5 Hz,H–6′) ，9.45 (s,1H,OH–3′),12.91 (s,1H,OH–5)。

1.2.2 化合物O7–苯基-O3′-苯四氮唑基香葉木素(3)的合成

在N2保護(hù)下，向化合物2(2.34 g，6 mmol)的KHCO3(0.6 g，6 mmol)DMF(30 mL)溶液中加入5–氯–1–苯基四氮唑(1.134 g，6.3 mmol)，升溫至120 °C，繼續(xù)攪拌1 h后停止反應(yīng)。冷卻、過濾、濃縮，得到的固體，通過硅膠柱層析(二氯甲烷與甲醇的體積比為98∶2)分離純化，得到黃色固體粉末3(2.20 g，收率69 %)。1H NMR (CDCl3) δ (ppm) : 3.87 (s,3H,OCH3–4′),5.11 (s,2H,CH2of benzyl),6.43 (s,1H,H–6),6.52 (s,1H,H–3),6.56 (s,1H,H–8),7.13 (d,1H,J = 8.5 Hz,H–5′),7.35–7.87 (m,12H,5H of benzyl,5H of phenyltetrazole,H–2′ and H–6′),12.65 (s,1H,OH–5)。

Fig.1 Synthesis route of compound O7–nitrooxybutylacacetin

1.2.3 刺槐素(4)的合成

向化合物3(2.10 g，3.94 mmol)的甲醇溶液(100 mL)中加入甲酸銨(1.5 g，24 mmol)和10 %Pd/C(0.5 g)，在N2保護(hù)下回流2.5 h。反應(yīng)停止后，冷卻、過濾，分別用甲醇、四氫呋喃洗滌至濾液無色。濾液濃縮得到的固體，用甲醇重結(jié)晶得到純的刺槐素4(0.728 g，收率65 %)。1H NMR (d6–DMSO) δ (ppm) : 3.86 (s,3H,OMe–4′),6.22 (d,1H,J=2.3 Hz,H–6),6.51 (d,1H,J=2.3 Hz,H–8),6.83 (s,1H,H–3),7.12 (m,2H,H–3′,5′),8.03 (m,2H,H–2′,6′),10.87 (s,1H,C7–OH),12.95 (s,1H,C5–OH)。

1.2.4 化合物O7-溴丁基刺槐素(5)的合成

向化合物4(0.568 g，2 mmol)的K2CO3(0.276 g，2 mmol)丙酮(60 mL)溶液中加入1,4–二溴丁烷(0.72 mL，6 mmol)，回流6 h后停止反應(yīng)。反應(yīng)液冷卻、抽濾、濃縮，將得到的固體通過柱層析用二氯甲烷洗脫，獲得黃色固體粉末5(0.635 g，收率76%)。1H NMR (CDCl3) δ(ppm)：1.86～2.02(m,4H,CH2CH2)，3.61～3.65 (t,2H,BrCH2),3.87 (s,3H,OMe–4′),4.06～4.09 (t,2H,CH2O),6.20 (d,1H,J=2.3 Hz,H–6),6.49 (d,1H,J=2.3 Hz,H–8),6.85 (s,1H,H–3),7.11 (m,2H,H–3′,5′),8.04 (m,2H,H–2′,6′),12.93 (s,1H,C5–OH)。

1.2.5 化合物O7-硝氧丁基刺槐素(6)的合成

向化合物5(0.418 g，1 mmol)的乙腈和四氫呋喃混合溶液中加入AgNO3(0.85 g，5 mmol)，在70 °C下避光反應(yīng)2 h后停止反應(yīng)。抽濾、濃縮濾液，將得到的固體通過硅膠柱色譜(乙酸乙酯與石油醚的體積比為1︰3)純化，獲得淺黃色固體粉末6(0.277 g，收率69 %)。1H NMR (CDCl3) δ (ppm) : 1.87～2.03 (m,4H,CH2CH2),3.87 (s,3H,OMe–4′),4.06～4.09 (t,2H,CH2O),4.62 (s,2H,NO2OCH2),6.21 (d,1H,J=2.3 Hz,H–6),6.52 (d,1H,J=2.3 Hz,H–8),6.87 (s,1H,H–3),7.12 (m,2H,H–3′,5′),8.05 (m,2H,H–2′,6′),12.95 (s,1H,C5–OH)；MS (FAB+) m/z: 402 [M+1]+；m.p.：157～158℃。

1.3 目標(biāo)化合物的體外NO 釋放測試

1.3.1 Greiss 試劑的配制

氨苯磺胺4 g、N–萘乙烯二胺鹽酸鹽0.2 g和85%磷酸10 mL用蒸餾水稀釋至100 mL。

1.3.2 亞硝酸鈉含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[9]、[10]中的方法，配制0.01，0.03，0.05，0.07，0.09，0.20，0.40 μg/mL的亞硝酸鹽系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取10 mL與Greiss 2.5 mL充分混勻，室溫放置10 min后，于540 nm測定其光密度。獲得線性回歸方程y =2.389 8x + 0.001 1，R2=0.998 5，其中y代表光密度，x代表亞硝酸鹽濃度(μg/ mL)。

1.3.3 目標(biāo)化合物釋放NO 能力的測試

將化合物6溶于0.01 mol/L二甲亞砜中，再用磷酸緩沖液稀釋。緩沖液里含有過量的半胱氨酸(5 mmol/L)，混勻，受試物終濃度為10－4mol/L。將溶液置于37 °C水浴中反應(yīng)1 h后，取反應(yīng)液1 mL與Greiss試劑250 μL混合,室溫放置10 min,于540 nm處測光密度。重復(fù)取2個(gè)樣本測定，NO釋放量以其相當(dāng)于氧化產(chǎn)物–亞硝酸鹽的量(μg/ mL)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物O7–硝氧丁基刺槐素的制備結(jié)果

溴代物的硝酸酯化，通常是將硝酸銀加入到無水乙腈中，然后加熱至50 °C，再迅速加入溴代物，升溫至70 °C反應(yīng)一定時(shí)間后，就可以得到目標(biāo)化合物[6]。本研究中采用該法合成目標(biāo)化合物時(shí)，混合液反應(yīng)8 h后通過TLC監(jiān)測，也未發(fā)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的生成。經(jīng)分析，認(rèn)為可能是O7–溴丁基刺槐素在乙腈中的溶解度太小，無法完成反應(yīng)，所以，加入其他溶劑來提高底物的溶解度，經(jīng)嘗試，加入適量的THF溶解溴代物后，再通過上述的方法可以合成化合物6。

2.2 目標(biāo)化合物6 的結(jié)構(gòu)

在化合物6的1H NMR譜圖中，δ 7.12 ppm出現(xiàn)了1個(gè)芳?xì)涞幕瘜W(xué)位移；在δ 1.87 ～ 2.03 ppm出現(xiàn)了4個(gè)氫的化學(xué)位移；在δ 4.62和δ 4.06～4.09分別出現(xiàn)了2個(gè)氫的化學(xué)位移。MS圖中[M+1]+m/z為402，在誤差允許范圍之內(nèi)，說明化合物為O7–硝氧丁基刺槐素。

2.3 目標(biāo)化合物的體外NO 釋放能力

因化合物6的NO體外釋放測試通常用Greiss法，本研究中采用該方法，測得化合物6能在體外釋放一定量的NO，其1 h時(shí)的釋放量為0.369 μg/mL。這與已報(bào)道的類似化合物的NO釋放能力相當(dāng)[9]。

3 結(jié) 論

依照NO–NSAIDs設(shè)計(jì)思想，設(shè)計(jì)、合成了1個(gè)新的有機(jī)硝酸類NO供體型刺槐素衍生物6。用核磁、質(zhì)譜對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行相應(yīng)的NO釋放能力測試，結(jié)果表明其能釋放一定量的NO。這為下一步的結(jié)構(gòu)修飾提供了思路，也為進(jìn)一步研究抗炎和抗血小板聚集準(zhǔn)備了化合物。

感謝內(nèi)蒙古大學(xué)為論文中的化合物進(jìn)行了氫譜和質(zhì)譜測試。

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