夏同偉，劉良坡，張文靜，申河清

(1．中國地質(zhì)大學(xué)(武漢) 環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430074;2．中國科學(xué)院 城市環(huán)境研究所，福建 廈門 361021;3．廈門大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361005)

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Endocrine disrupting chemicals，EDCs)指一些外源性物質(zhì)，它們會(huì)導(dǎo)致未受損傷的有機(jī)體發(fā)生逆向健康影響，或使有機(jī)體后代的內(nèi)分泌功能發(fā)生改變。EDCs具有生殖發(fā)育毒性，有些還具有持久性和生物累積性［1］。生物檢測(cè)結(jié)果表明人體的尿液、乳汁、血液和精液等體液及組織(如胎盤)中均含有雙酚 A(BPA)［2－7］和三氯生(TCS)［8－11］。BPA 對(duì)大鼠和小鼠具有發(fā)育毒性［12］，并且能干擾雄性生殖活動(dòng)的某些機(jī)制，影響機(jī)體的免疫功能［13］。TCS能在各種生物體內(nèi)累積和富集，且能夠誘發(fā)DNA損傷，具有遺傳毒性［14］。炔雌酮(EE2)、雌酮(E1)、雌二醇(E2)屬于類固醇類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有更強(qiáng)的內(nèi)分泌干擾能力［15－17］，其中，E1是E2在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物，EE2是人工合成的雌激素，具有極強(qiáng)的雌激素活性，且具有生物蓄積性［18－20］。

圖1 5種酚類化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of five phenolic endocrine disrupting chemicals(EDCs)

目前檢測(cè)水環(huán)境中BPA、TCS、E1、E2和EE2的方法已較為成熟［21－22］。配備通用電噴霧離子源的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC－ESI MS/MS)技術(shù)具有較高的靈敏度、選擇性和重現(xiàn)性，可確保復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確定量，也是目前分析環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的常用檢測(cè)方法［14，23］。但鮮有采用HPLCESI MS/MS技術(shù)同時(shí)測(cè)定人尿液中這5種污染物的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究運(yùn)用液－液萃取的前處理方法，建立了HPLC－ESI MS/MS結(jié)合穩(wěn)定性同位素稀釋的分析技術(shù)，并將其應(yīng)用于成人尿液中BPA、TCS、E1、E2和EE25種酚類化合物的含量測(cè)定(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)，同時(shí)對(duì)成人尿液中上述酚類化合物的暴露情況作了初步評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(日本島津);Applied Biosystems/MSD SCIEX質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司);氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司);渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);Mikro22k離心機(jī)(德國Hettich公司);超純水裝置(美國Pall公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品:BPA(美國AccuStandard標(biāo)準(zhǔn)品公司);TCS和E1(純度均＞98%，美國Sigma－Aldrich公司);E2和EE2(德國Dr.Ehrenstorfer化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品公司);3種定量?jī)?nèi)標(biāo)溶液為13C12BPA、13C12TCS(Cambridge Isotope Laboratories Ins，USA)和 E2－ D4(C/D/N Isotopes，Inc，Pointe － Claire，Quebec，Canada);E1、E2和EE2用E2－D4作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。乙腈、甲醇、正己烷、丙酮(色譜純，美國Honeywell公司);甲酸(分析純，中國上海試劑總廠);超純水(Cascada TM AN，美國Pall公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源(ESI+);檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);離子源溫度:450℃;離子噴霧電壓:4 500 V;氣簾氣:10.0 psi;碰撞活化解離:中度。5種酚類化合物及內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 5種酚類化合物及內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Optimized parameters of five EDCs and internal standard substances

1.2.2 色譜條件 色譜柱:Phenomenex Kinetex C18(3 μm，100 mm×4.6 mm i.d．);流動(dòng)相:0.1%甲酸水溶液(A)－甲醇(B)，線性梯度洗脫:0～5 min，由55%B線性變?yōu)?5%B，然后保持5 min，最后6 min由95%B線性降至55%B;柱溫:35℃;進(jìn)樣體積:20 μL;洗脫流速:0.6 mL/min。

1.3 樣品處理

1.3.1 酶 解 將儲(chǔ)存于－80℃的尿液自然解凍，準(zhǔn)確移取1 mL尿液于15 mL試管中，依次加入20 μL 5 μg/L的定量?jī)?nèi)標(biāo)溶液和1 mL pH 4.5的NaAc－HAc(0.15 mol/L)緩沖溶液以及10 μL的葡萄糖酸(150 units/mL的β-葡萄糖酸酶+4.2 units/mL的硫酸酯酶)，混合均勻，37℃條件下酶解2 h。

1.3.2 衍 生 酶解后的尿樣采用液－液萃取法提取目標(biāo)物，每次加3 mL正己烷，萃取2次，合并正己烷萃取液，氮?dú)獯蹈珊?，依次加?.5 mL丙酮、100 μL 1 mg/L溶解于丙酮的丹磺酰氯，以及100 μL pH 10.5的Na2CO3(0.1 mol/L)緩沖溶液，混合均勻，50℃溫浴30 min進(jìn)行衍生反應(yīng)。衍生后，用正己烷再次萃取，每次加3 mL，萃取2次，離心分層，合并正己烷萃取液，氮?dú)獯蹈?用甲醇定容至200 μL;7 000 r/min離心或過膜，收集上清液，待HPLC－ESI MS/MS分析。

1.4 定性與定量分析

以相對(duì)保留時(shí)間和被測(cè)物相應(yīng)的監(jiān)測(cè)離子的豐度進(jìn)行定性分析。分別將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣注入HPLC－MS/MS系統(tǒng)，記錄5種酚類化合物的峰面積以及相應(yīng)的同位素的峰面積。利用1.5 Version analyst software軟件建立的定量分析方法，以各系列標(biāo)準(zhǔn)液的進(jìn)樣濃度與對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)峰面積比繪制線性定量曲線，根據(jù)定量分析軟件進(jìn)行定量分析。

1.5 質(zhì)量控制與保證(QA/QC)

為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，每批14個(gè)樣品，包含2個(gè)方法空白和4個(gè)質(zhì)量控制(兩個(gè)低濃度和兩個(gè)高濃度)，實(shí)際樣品的含量扣除空白值。樣品處理前均加入同位素內(nèi)標(biāo)。空白加標(biāo)進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果進(jìn)行回收率校正。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)選擇正己烷作提取溶劑，采用液－液萃取法提取，取得了較好的效果。由于所研究酚類化合物在尿液中主要以葡萄糖醛苷或硫酸芳酯結(jié)合的不同形式存在，所以需要對(duì)樣品進(jìn)行酶解［24］，將待測(cè)目標(biāo)物從其共軛化合物中完全釋放出來。比較了加入不同單位的酶的效果，發(fā)現(xiàn)加入10 μL葡萄糖酸(150 units/mL的β-葡萄糖酸酶+4.2 units/mL的硫酸酯酶)后可使目標(biāo)化合物從其共軛化合物中完全釋放。由于尿液中目標(biāo)分析物的含量很低(μg/L級(jí))，為了提高液相色譜－質(zhì)譜的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度，采用丹磺酰氯［25］對(duì)待測(cè)物進(jìn)行衍生化處理?？疾炝思尤氩煌w積(10、50、100、150 μL)質(zhì)量濃度為1 g/L的丹磺酰氯作衍生劑時(shí)對(duì)目標(biāo)物強(qiáng)度的影響，結(jié)果顯示，目標(biāo)物的信號(hào)強(qiáng)度隨著丹磺酰氯體積的增加而增強(qiáng)，當(dāng)加入量大于100 μL時(shí)目標(biāo)化合物的響應(yīng)強(qiáng)度無明顯變化，本實(shí)驗(yàn)選擇加入100 μL 1 g/L的丹磺酰氯為衍生劑。

2.2 流動(dòng)相的選擇

目標(biāo)分析物的良好分離對(duì)于檢測(cè)方法的建立有著重要作用。參考血漿中有關(guān)雌激素的測(cè)定方法［25－28］，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化流動(dòng)相、流動(dòng)相比例?？疾炝艘译妫图状迹畠山M流動(dòng)相體系對(duì)目標(biāo)化合物的離子化程度及分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇－水體系梯度洗脫時(shí)5種酚類化合物的分離效果較好，因此實(shí)驗(yàn)選用甲醇－水作為流動(dòng)相。正離子檢測(cè)模式下，為提高待測(cè)物的離子化效率，獲得最佳的分辨率和較高的靈敏度，在流動(dòng)相中加入0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸進(jìn)行緩沖以增加5種酚類化合物的電離效率和抑制色譜峰拖尾。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

為了獲得高靈敏度的質(zhì)譜條件，采用流動(dòng)注射分析儀將經(jīng)丹磺酰氯衍生后的1 mg/L的5種酚類化合物及其同位素單標(biāo)溶液直接注入質(zhì)譜檢測(cè)器，先用全掃描(Scan)模式得到準(zhǔn)分子離子，再采用選擇離子(SIM)方式進(jìn)行采集，以獲得較好的質(zhì)譜條件。5種酚類化合物的監(jiān)測(cè)離子參數(shù)見表1。5種酚類化合物及其同位素的標(biāo)準(zhǔn)提取離子流色譜圖如圖2所示。成人尿液中5種酚類化合物的提取離子流色譜圖如圖3所示。

圖2 5種酚類化合物的標(biāo)準(zhǔn)提取離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of five EDCs standard

圖3 成人尿液中5種酚類化合物的提取離子流色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of five EDCs in adult urine

2.4 空白基質(zhì)的選擇

采用含5種酚類化合物濃度極低的尿液作為基質(zhì)空白。將加入一定量活性炭粉末的尿樣于4℃條件下恒溫?cái)嚢?0 h，以充分吸附酚類化合物。3 000 r/min離心分離10 min后，取上清液，過濾膜后得到含極低濃度的5種酚類化合物的空白尿液，4℃條件下保存待用。

2.5 線性關(guān)系與檢出限

以甲醇配制濃度分別為0、0.05、0.2、1.0、5.0、25、50、100 μg/L的5種酚類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，內(nèi)標(biāo)濃度均為5.0 μg/L。以各目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值(Y)對(duì)目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，目標(biāo)物信號(hào)強(qiáng)度在0.2～100 μg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2值均不低于0.998。以信噪比S/N=3作為儀器的檢出限(LOD)，S/N=10作為儀器的定量下限(LOQ)，結(jié)合樣品前處理的稀釋倍數(shù)計(jì)算得到各化合物的檢出限為0.02～0.27 μg/L，定量下限為0.07～0.87 μg/L。表2為5種酚類化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限。

表2 5種酚類化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限Table 2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients(r2)，LODs and LOQs of five EDCs

2.6 準(zhǔn)確度與精密度

為評(píng)價(jià)本方法的準(zhǔn)確度，采用“2.4”含有低濃度目標(biāo)物的尿液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，并以多次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)評(píng)價(jià)方法的精密度。計(jì)算回收率結(jié)果時(shí)扣除樣品的本底值。在空白基質(zhì)中分別添加低、中、高3個(gè)水平的目標(biāo)分析物，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。由表3可見，加標(biāo)水平為5～50 μg/L時(shí)，目標(biāo)分析物的回收率在85%～125%之間，RSD在0.53%～14.4%之間，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表3 5種酚類化合物的回收率與精密度(n=3)Table 3 Recoveries and precisions of five EDCs(n=3) /%

2.7 實(shí)際樣品分析

將建立的方法應(yīng)用于40個(gè)健康成人志愿者尿液中5種酚類化合物的含量測(cè)定。結(jié)合樣品前處理的稀釋倍數(shù)計(jì)算5種酚類化合物的含量，酶解后的測(cè)定結(jié)果見表4。暴露水平以及相關(guān)性分析等后續(xù)處理及分析均基于表4所列數(shù)據(jù)。

表4 40個(gè)志愿者尿液中5種酚類化合物的定量結(jié)果Table 4 Quantitative results of five EDCs of 40 volunteers ρ/(μg·L－1)

2.7.1 成人尿液中5種酚類化合物的暴露水平 比較了成人尿液中BPA、TCS、E1、E2和EE2之間的差異，酶解后尿液中酚類化合物的暴露水平如表5所示。結(jié)果顯示，這5種酚類化合物在所研究人群的尿液中廣泛存在，且個(gè)體間不同污染物的暴露劑量存在明顯差異。不同酚類化合物的暴露劑量不同，平均濃度依次為TCS＞E1＞E2＞BPA＞EE2。

表5 成人尿樣中5種酚類化合物暴露水平(n=40)Table 5 The exposure level of five EDCs in adult urine(n=40)

表6 成人尿液中5種酚類化合物的Spearman相關(guān)性Table 6 Spearman correlations of five EDCs in adult urine

2.7.2 成人尿液中5種酚類化合物的相關(guān)性分析 采用SPSS軟件中Shapiro－wilk s W檢驗(yàn)對(duì)暴露數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)呈非正態(tài)性，經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后仍呈非正態(tài)。由于數(shù)據(jù)呈非正態(tài)性，因此采用軟件(SPSS 13.0)中的Spearman非參數(shù)相關(guān)性分析對(duì)5種EDCs的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表6。相關(guān)性結(jié)果顯示，E1與E2、EE2呈顯著正相關(guān)(r=0.80，0.44);E1與BPA和TCS無顯著性差異。研究結(jié)果表明，E1與E2、EE23種化合物可能具有共同的暴露源，初步的研究結(jié)果需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用液－液萃取的前處理方法，通過優(yōu)化色譜、質(zhì)譜條件，建立了用于測(cè)定成人尿液中5種酚類化合物的HPLC－ESI MS/MS結(jié)合穩(wěn)定性同位素稀釋的分析方法，并對(duì)尿樣中5種酚類化合物的暴露水平進(jìn)行了評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所研究人群廣泛暴露于這5種酚類化合物，且E1與E2、EE2相關(guān)性較高，它們可能具有共同的暴露源。該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、回收率高、操作簡(jiǎn)單，適合于尿液中5種酚類化合物的暴露評(píng)價(jià)分析。

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