邊 敏，楊 勇，周 昊

(1．南京工業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，江蘇 南京 210009;2．南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210046)

辣椒素類生物堿是一類由茄科植物辣椒的成熟果實(shí)中提取得到的辛辣有效成分，主要包括辣椒堿(Capsaicin，CAP)、二氫辣椒堿(Dihydrocapsaicin，DHC)和降二氫辣椒堿(Nordihydrocapsaicin，NDHC)，其中辣椒堿與二氫辣椒堿為辣椒中的主要成分，約占辣椒總含量的90%［1］。3種化合物結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 辣椒素類生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of capsaicin-type alkaloids

目前辣椒素類生物堿在臨床上已有較多應(yīng)用［2－5］，分離測(cè)定方法主要有HPLC、GC－MS和LCMS［6－8］。其中GC－MS在測(cè)定時(shí)為增加樣品的揮發(fā)性，需要提前衍生化，LC－MS的測(cè)定成本較高，故辣椒素類生物堿的分離測(cè)定以液相色譜為主。為了提高分離度，現(xiàn)多采用增加色譜柱長(zhǎng)度和梯度洗脫的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。本課題組前期的研究結(jié)果表明，以室溫離子液體(RTILs)為流動(dòng)相添加劑分離生物堿可獲得良好的分離效果［9］，故本研究擬利用離子液體作為流動(dòng)相添加劑分離辣椒素類生物堿，考察分離條件及影響因素，并利用溶質(zhì)計(jì)量置換保留模型(SDM－R)，初步探討分離機(jī)理，為此類生物堿的分離提供了新的方法和思路。

1 溶質(zhì)計(jì)量置換保留模型

溶質(zhì)計(jì)量置換保留模型的簡(jiǎn)化數(shù)學(xué)表達(dá)式為［10］:

其中k'為容量因子，αD為流動(dòng)相中置換劑的活度，線性參數(shù)lgI和Z均為常數(shù)。lgI表示1 mol溶質(zhì)對(duì)固定相的親和勢(shì)，Z表示1 mol溶劑化溶質(zhì)被溶劑化固定相吸附時(shí)在兩者的接觸表面上釋放出置換劑的摩爾總數(shù)。

根據(jù)該模型，實(shí)驗(yàn)中分別考察了甲醇及離子液體濃度變化與組分容量因子的關(guān)系，以此確定在此保留過(guò)程中的置換劑，初步探討離子液體在分離過(guò)程中的作用機(jī)理。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Shimadzu高效液相色譜系統(tǒng):LC－20AD泵，SPD－20A檢測(cè)器，7125進(jìn)樣器，Class－VP色譜工作站。pHs－3C精密pH計(jì)、E－201－C pH復(fù)合電極(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

辣椒堿、二氫辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司);離子液體CnminBF4(n=1、2、4、6、8、10、12)，1-丁基-3-甲基咪唑氯化鹽(BmimCl)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道合成［11－12］，經(jīng)莫爾法、分光光度法測(cè)定純度大于97%;甲醇(色譜純，Concord);磷酸(優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司);實(shí)驗(yàn)用水為三蒸水(自制)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 溶液的配制 分別精密稱取辣椒堿、二氫辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得辣椒堿質(zhì)量濃度為407 mg·L－1、二氫辣椒堿質(zhì)量濃度為411 mg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。移取兩種貯備液各5.0 mL至250 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，搖勻得標(biāo)準(zhǔn)品混合液。標(biāo)準(zhǔn)溶液保存于4℃冰箱內(nèi)。使用時(shí)放至室溫，過(guò)0.45 μm濾膜。

2.2.2 色譜條件 色譜柱:ODS柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent TC－C18)，等度洗脫，流動(dòng)相:甲醇－水(30∶70)，流速:0.7 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm，柱溫:25℃。另向流動(dòng)相中以5.2 mmol·L－1的濃度加入 BmimBF4。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

分別以甲醇－水(30∶70)、甲醇－水(40∶60)、甲醇－水(30∶70，加入BmimBF4作添加劑)為流動(dòng)相，考察了不同流動(dòng)相體系對(duì)辣椒素類生物堿的保留效果及影響(見(jiàn)圖2)。由圖可知:①CAP與DHC在無(wú)添加劑的甲醇－水系統(tǒng)中即可達(dá)基線分離，峰形基本對(duì)稱(圖2A、B)。這是因?yàn)閮烧咴诮Y(jié)構(gòu)上僅飽和度不同，與DHC相比，CAP增加1個(gè)不飽和雙鍵，保留減小。同時(shí)由于其堿性較弱，在此分離條件下多數(shù)呈非質(zhì)子化形式，與反相柱的殘余硅羥基作用較弱，故幾乎無(wú)拖尾;②CAP與NDHC在無(wú)添加劑流動(dòng)相體系中無(wú)法達(dá)到基線分離(圖2A、B)。這是因?yàn)榕cCAP相比，NDHC雖然少了不飽和雙鍵，保留增大，但同時(shí)碳鏈變短，疏水性減弱，保留減小?？偟淖饔媒Y(jié)果使得兩者在甲醇－水體系中的保留特性接近;③在流動(dòng)相中加入低濃度的BmimBF4(5.2 mmol·L－1)后，可使CAP在NDHC之前出峰，并達(dá)到基線分離，同時(shí)3種生物堿的保留均有所減小，峰形得到改善，分離效率顯著提高(圖2C)。說(shuō)明在此類生物堿的分離過(guò)程中，離子液體的加入使各組分的保留減小，但同時(shí)也可選擇性地使NDHC的保留相對(duì)增大，提高了其與CAP的分離度。

圖2 辣椒素類生物堿的色譜圖Fig.2 Chromatograms of capsaicin type alkaloids

3.2 流動(dòng)相中甲醇含量對(duì)分離特性的影響

根據(jù)公式(1)，如將有機(jī)溶劑設(shè)為置換劑，且有機(jī)溶劑濃度與組分保留值之間呈線性關(guān)系，則說(shuō)明有機(jī)溶劑是優(yōu)先將固定相溶劑化，并作為流動(dòng)相的強(qiáng)溶劑在分離過(guò)程中起主導(dǎo)作用，而離子液體的作用則以離子對(duì)試劑為主。將室溫離子液體設(shè)為置換劑，若離子液體的濃度與組分保留值滿足公式(1)，即說(shuō)明在整個(gè)分離過(guò)程中，離子液體優(yōu)先被吸附到固定相上，將固定相溶劑化，其與被分離組分之間的作用以競(jìng)爭(zhēng)吸附為主。故在實(shí)驗(yàn)中，分別配制含不同比例甲醇的流動(dòng)相，考察有機(jī)相比例對(duì)分離的影響。結(jié)果見(jiàn)圖2A、B。當(dāng)甲醇含量降低時(shí)，組分的保留相應(yīng)增強(qiáng)，分離度略有提高，但無(wú)法使CAP與NDHC達(dá)到基線分離。向流動(dòng)相中加入5.2 mmol·L－1的BmimBF4，并分別配制體積比為25∶75、30∶70、35∶65、40∶60的甲醇－水流動(dòng)相，考察甲醇含量對(duì)組分保留的影響。結(jié)果顯示各組分的保留隨甲醇含量的減少而增加，分離效率基本不變。根據(jù)式(1)，將組分容量因子與甲醇體積比求對(duì)數(shù)線性關(guān)系，得SDM－R線性參數(shù)(見(jiàn)表1)。

表1 甲醇作置換劑時(shí)SDM－R各參數(shù)值Table 1 Stoichiometric parameters of different analytes with methanol as displacer

結(jié)果顯示，在此分離系統(tǒng)中，若以甲醇為強(qiáng)溶劑，并作為分離過(guò)程中的置換劑，組分容量因子與甲醇濃度之間的對(duì)數(shù)線性關(guān)系較差(r＜0.9)。說(shuō)明在此吸附保留過(guò)程中，甲醇對(duì)固定相的溶劑化作用并不占主導(dǎo)地位，不參與組分在固定相上的競(jìng)爭(zhēng)吸附。即在此流動(dòng)相體系中，甲醇僅作為洗脫劑，改變流動(dòng)相的洗脫能力，但并未參與組分的競(jìng)爭(zhēng)吸附和保留過(guò)程。

圖3 BmimCl為添加劑時(shí)的分離色譜圖Fig.3 Chromatogram of capsaicin-type alkaloids with mobile phase containing BmimCl

3.3 離子液體種類的選擇

分別考察了不同烷基鏈長(zhǎng)度陽(yáng)離子和不同離液序列陰離子對(duì)分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)離子液體陰離子為低離液序列的Cl－時(shí)，無(wú)論烷基鏈長(zhǎng)度如何變化，均無(wú)法實(shí)現(xiàn)CAP與NDHC的基線分離，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可見(jiàn)，雖然各組分的峰形明顯改善，分離效率提高，但NDHC仍在CAP前出峰，且未達(dá)基線分離。只有當(dāng)陰離子離液序列較高時(shí)(如，)，兩者的出峰順序改變，并達(dá)到基線分離。這可能是因?yàn)镹DHC與CAP的結(jié)構(gòu)中相差一個(gè)不飽和雙鍵，其形成的π電子云與p－π電子云共軛，導(dǎo)致CAP支鏈上局部電子云密度下降，堿性降低。故在相同化學(xué)環(huán)境下，CAP大部分以中性分子形式存在，僅有少部分質(zhì)子化，且質(zhì)子化的比例小于NDHC。當(dāng)高離液序列陰離子存在時(shí)，CAP形成離子對(duì)的比例小于NDHC，保留減小。而低離液序列陰離子無(wú)法形成中性離子對(duì)［13－14］，故無(wú)法使兩個(gè)堿性略有差異的組分分離。因此，本實(shí)驗(yàn)采用高離液序列陰離子組成的離子液體，即CnminBF4為添加劑，并進(jìn)一步考察了CnminBF4鏈長(zhǎng)變化對(duì)分離特性的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同烷基鏈長(zhǎng)離子液體作添加劑分離辣椒素類生物堿的色譜參數(shù)值Table 2 Chromatographic parameters with RTILs having different length of alkyl groups as a dditives

由表2可見(jiàn)，隨著烷基鏈長(zhǎng)度(n)的增加，各組分的容量因子減小，同時(shí)有效理論塔板數(shù)增大，CAP與NDHC的分離度先增大后減小。這可能是因?yàn)殡S著烷基鏈長(zhǎng)度的增加，離子液體的疏水性增大，導(dǎo)致離子液體與固定相表面的吸附力更強(qiáng)，與組分競(jìng)爭(zhēng)吸附的能力增大;同時(shí)離子液體的表面張力減小，流動(dòng)相的表面張力隨之減弱且洗脫力增加，組分保留減小。若以有效理論塔板數(shù)和分離度為指標(biāo)衡量分離效率，對(duì)于pKa＜2的酰胺類生物堿，由高疏水性的長(zhǎng)烷基鏈陽(yáng)離子和高離液序列陰離子組成的離子液體更適合，且分離時(shí)間短、分離效率高。

3.4 離子液體濃度的影響

改變離子液體BmimBF4的濃度(2.6～83.4 mmol·L－1)，考察了各組分保留的變化，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，各組分的保留隨離子液體濃度的增大而減小。

表3 不同濃度下不同烷基鏈長(zhǎng)的離子液體作添加劑時(shí)各組分的保留值Table 3 Chromatographic parameters with RTILs having different length of alkyl groups and different concentration as additives

將lgk'～lgαD求線性，得SDM－R第一線性方程，各參數(shù)值見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，當(dāng)n=10時(shí)，組分保留隨離子液體濃度變化的線性關(guān)系下降(r＜0.99)，說(shuō)明當(dāng)烷基鏈長(zhǎng)度增加到一定值時(shí)，離子液體在固定相上的親和勢(shì)增大，形成的溶劑化層不再是理想的單分子層，組分被吸附至固定相時(shí)，被置換到溶液中的溶劑分子數(shù)目不再遵循SDM－R中的線性關(guān)系。

此外，n=4～8的良好線性關(guān)系表明，相比于苦參類生物堿［9］，酰胺類生物堿的lgk'與lgαD的線性擬合程度更高，基本可達(dá)到r＞0.99。這是因?yàn)榇祟惿飰A的堿性更弱，在分離過(guò)程中以非質(zhì)子化中性分子存在的比例更多，組分與離子液體的置換吸附作用更強(qiáng)，所以線性關(guān)系更明確。該結(jié)果進(jìn)一步證明了當(dāng)離子液體作添加劑時(shí)，非質(zhì)子化組分分子與離子液體置換劑之間的作用符合SDM－R。

表4 離子液體濃度變化時(shí)各組分SDM－R模型的參數(shù)值Table 4 Stoichiometric parameters of different analytes with different concentration ionic liquids as displacer

圖4 柱溫的影響Fig.4 Effect of column temperature

3.5 柱溫的影響

考察了柱溫(298、303、308、313 K)對(duì)組分保留的影響。根據(jù)范特霍夫方程(lgk'=ΔH/(RT)+ΔS/(RT)+lgφ)，將各組分容量因子的對(duì)數(shù)與柱溫的倒數(shù)進(jìn)行線性擬合，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可知，柱溫升高導(dǎo)致各組分的容量因子依次降低。以lgk'～1/T作圖，可得良好的線性關(guān)系，符合范特霍夫公式。造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于溫度對(duì)各組分電離常數(shù)的影響所致。即隨著溫度升高，電離常數(shù)減弱，形成質(zhì)子化的比例減小，相應(yīng)的中性離子對(duì)的比例減小，保留減小。故在保證分離度的前提下，此類生物堿的分離可選擇在一定溫度下進(jìn)行，本實(shí)驗(yàn)選擇柱溫25℃。

4 結(jié)論

本文首次以離子液體為添加劑，建立了以辣椒堿、二氫辣椒堿與降二氫辣椒堿為代表的酰胺類生物堿的分離分析方法，并考察各種因素對(duì)分離的影響，利用各組分的色譜參數(shù)值建立分離模型，初步探討其分離機(jī)理。結(jié)果表明當(dāng)向流動(dòng)相中加入由高疏水性的長(zhǎng)烷基鏈陽(yáng)離子和高離液序列陰離子組成的離子液體時(shí)，各組分的峰形得到改善，分離效率明顯提高，同時(shí)保留減弱。此外，離子液體作為置換劑，其鏈長(zhǎng)、濃度與組分保留值的變化與SDM－R擬合程度較好，即分離作用過(guò)程完全符合溶質(zhì)計(jì)量置換模型。

［1］ Tu D W，Li Y F．Chin.Agric.Sci.Bull.(屠大偉，李沿飛．中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào))，2008，(24):145－148．

［2］ Dong J，Zhang G H，Wang H T．Food Sci.Technol.(董靜，張國(guó)輝，王洪濤．食品科技)，2006，(31):601－603．

［3］ Zhao R B，Cui T，Guo X M．J.Agric.Univ.Hebei(趙仁邦，崔同，果秀敏．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))，2002，(25):134－136．

［4］ Zheng C Q．Chin.J.Ophthalmol.Otolaryngol.(鄭春泉．中國(guó)眼耳鼻喉科雜志)，2001(6):125－127．

［5］ Watson C P，Tyler K L．Clin.Ther．，1993，15:510 －526．

［6］ Gerardo F B，Miguel P，Carmelo G B．Anal.Chim.Acta，2006，578:227 －233．

［7］ Ute S，Reinhold C，Andreas S．Anal.Chim.Acta，2006，557:236 －224．

［8］ Manirakiza P，Covaci A，Schepens P．J.AOAC Int．，1999，82:1399 －1406．

［9］ Bian M，Zhang Z J，Yin H．J.Pharm.Biomed．，2012，58:163 －167．

［10］ Geng X D，Regnier F E．J.Chromatogr．，1984，296:15 －30．

［11］ Dyson P J，Srinivasan M C，Vine T，Welton T，Williams D J，White A J P，Zigras T．J.Chem.Soc.Dalton Trans．，1997，19:3465－3469．

［12］ Suarez P A Z，Dullius J E L，Einloft S，De Souza R F．Dupont J.Polyhedron，1996，15:1217 －1219．

［13］ Hisham H，Thomas J．J.Chromatogr.A，2006，1133:69－75．

［14］ Zhao J G，Yao C，Wei Y M，Geng X D．Chin.J.Chromatogr.(趙建國(guó)，姚叢，衛(wèi)引茂，耿信篤．色譜)，2001，19:481－484．