趙蘭鳳，胡偉，劉小鋒，張亮，李華興

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510642

根系分泌物是植物與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交流的重要媒介, 是構(gòu)成植物不同根系微生態(tài)環(huán)境特征的主要物質(zhì)之一。因此，研究根系分泌物對(duì)于進(jìn)一步明確植物的生理活動(dòng)規(guī)律及其與環(huán)境之間的關(guān)系具有重要的理論和實(shí)際意義[1]。植物根系分泌物作為寄主自身抗病性的第一階段(侵染前階段)起著不可忽視的作用。Larkin[2]在研究連種西瓜對(duì)枯萎菌及根際微生物群落的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)在連種抗病品種的田塊中，即便加入中等量的病原菌和種植感病品種，發(fā)病率也不會(huì)很高，而在種植感病品種的田塊中仍保持很高的發(fā)病率。也有研究表明，小麥根系分泌物可以明顯控制病原菌引起的全蝕病和粉霉病等病害[3], 水葫蘆根系分泌物能抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)[4]。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)環(huán)境脅迫下植物根系分泌物的研究主要集中在根系分泌物的種類(lèi)和數(shù)量、分泌物與環(huán)境因子的相互聯(lián)系以及植物體的響應(yīng)上，雖然也有一些關(guān)于植物土傳病害與根系分泌物關(guān)系方面的研究報(bào)道[5-7]，而施用生物有機(jī)肥防治香蕉枯萎病與根系分泌物的關(guān)系研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。生物有機(jī)肥的施用作為防治香蕉枯萎病的有效措施之一[8-9]，無(wú)疑會(huì)改變根系分泌物的數(shù)量和組成，進(jìn)而影響其防病效果。深入研究生物有機(jī)肥對(duì)香蕉根系分泌物組成及活性物質(zhì)影響，對(duì)于探討生物有機(jī)肥的抗病機(jī)制具有重要意義。本研究通過(guò)盆栽試驗(yàn)和離位溶液培養(yǎng)法研究了生物有機(jī)肥對(duì)香蕉枯萎病及香蕉根系分泌物的影響，試圖探討生物有機(jī)肥在植物-土壤-微生物三者之間的作用及其防病機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土壤

采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)由赤紅壤發(fā)育而成的水稻土。其主要理化性質(zhì)為：質(zhì)地為輕壤土；w(有機(jī)質(zhì))=12.1 g·kg-1；pH值5.98；w(堿解N)、w(有效P)和w(速效K)分別為50.0、46.0和143.1 mg·kg-1。測(cè)定方法參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[10]。

表1 供試肥料的基本性質(zhì) Table 1 Basic characteristics of two fertilizers

1.1.2 供試肥料

供試肥料及其基本性質(zhì)如表1所示。

1.1.3 供試作物

香蕉：巴西焦(Musa acuminata AAA Cavendish cv. Brazil)，營(yíng)養(yǎng)杯組培苗，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所提供。

1.1.4 病原菌 尖孢鐮刀菌古巴專(zhuān)化型4號(hào)生理小種Fusarium oxysopoyum f. sp. cubence race 4 (Foc4)。

1.1.5 生物有機(jī)肥料中添加菌種

解淀粉芽孢桿菌(AF11b，B. amyloliquefaciens)，由本試驗(yàn)室篩選、分離并鑒定，對(duì)香蕉枯萎病病原菌FOC4有較強(qiáng)的拮抗能力。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用盆栽的方式，2011年5月在資源環(huán)境學(xué)院網(wǎng)室中進(jìn)行。試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理，分別為不施肥處理(CK)、施有機(jī)肥處理(OF)和施生物有機(jī)肥處理(BOF)。每個(gè)處理設(shè)20個(gè)重復(fù)，共60盆。

每盆裝風(fēng)干土(過(guò)3 mm篩)5 kg，生物有機(jī)肥和有機(jī)肥施用量為8 g·kg-1土，全部作為底肥與土壤混勻。土壤澆水平衡5 d后移栽香蕉苗，選擇生長(zhǎng)大小一致香蕉苗移植，每盆種植1株香蕉苗，在移栽的同時(shí)采用灌根法接種病原菌，病原菌菌液中孢子濃度為105mL-1，每盆澆20 mL。觀察香蕉生長(zhǎng)和枯萎病發(fā)生情況，生長(zhǎng)30 d后收獲蕉苗，觀察地上部莖、葉黃化和枯萎情況，切開(kāi)根部記錄褐變程度。香蕉枯萎病病情指數(shù)和防病效果計(jì)算參考相關(guān)文獻(xiàn)[11]。

1.2.2 根系分泌物提取

根系分泌物收集采用離位溶液培養(yǎng)法[12-13]：將盆栽中的蕉苗從土壤中拔出，先用自來(lái)水沖洗3～5次，洗掉附著的土粒，之后用超純水沖洗2～3次。將蕉苗置入50 mL 5 mmol·L-1氯化鈣溶液中避光收集根系分泌物，每4株放入一個(gè)收集瓶中。連續(xù)收集6 h，慢速過(guò)濾(0.45 μm的微孔濾膜)。將收集到的根系分泌物定容到50 mL，取35 mL濾液真空冷凍干燥至干，加0.5 mL去離子水溶解，用于分析氨基酸。取15 mL濾液真空冷凍干燥至干，加1 mL去離子水溶解，用于分析低分子量有機(jī)酸。

1.2.3 根系分泌物中有機(jī)酸和氨基酸測(cè)定

（1）氨基酸組分測(cè)定：用日本L-8800氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

（3）有機(jī)酸類(lèi)型和質(zhì)量濃度采用高效液相色譜測(cè)定。安捷倫LC1100液相色譜儀（美國(guó)產(chǎn)），流動(dòng)相：5 mmol·L-1H2SO4，流速：0.5 mL·min-1，進(jìn)樣量：10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003和DPS 7.05軟件處理，顯著性水平采用Duncun’s新復(fù)極差法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物有機(jī)肥對(duì)香蕉枯萎病的防治效果

接種香蕉枯萎病菌10 d后，不施肥處理(CK)最先開(kāi)始發(fā)病，有機(jī)肥處理(OF)和生物有機(jī)肥處理(BOF)推遲香蕉枯萎病的發(fā)生。CK發(fā)病明顯，而且發(fā)病株數(shù)最多，OF次之，種植30 d時(shí)病情指數(shù)如圖1所示，BOF和OF防病效果分別達(dá)到55.4%和28.5%。說(shuō)明施生物有機(jī)肥和有機(jī)肥可顯著降低香蕉枯萎病的發(fā)病率。

圖1 不同處理對(duì)香蕉枯萎病病情指數(shù)影響 Fig.1 Influence of different treatments on banana wilt disease index

2.2 生物有機(jī)肥對(duì)根系分泌物中有機(jī)酸質(zhì)量濃度的影響

從香蕉根系分泌物中的有機(jī)酸結(jié)果(表2)可以看出，香蕉根系分泌物中包括3種低分子量有機(jī)酸，其中草酸質(zhì)量濃度最高，蘋(píng)果酸質(zhì)量濃度次之，與張志紅[11]測(cè)定結(jié)果相似。OF和BOF處理根系分泌物中草酸和反丁烯二酸質(zhì)量濃度顯著高于CK，蘋(píng)果酸質(zhì)量濃度則是CK和OF顯著高于BOF，反丁烯二酸質(zhì)量濃度甚微，變化趨勢(shì)與草酸相似，且OF處理顯著高于BOF處理。影響有機(jī)酸總量的主要有機(jī)酸為草酸，不同處理根系分泌物的有機(jī)酸質(zhì)量濃度為OF＞BOF＞CK，差異均達(dá)到顯著水平。上述結(jié)果表明，施肥可顯著影響根系分泌物中有機(jī)酸的質(zhì)量濃度。與OF處理相比，BOF顯著降低了根系分泌物中有機(jī)酸質(zhì)量濃度，表明生物有機(jī)肥中添加的功能菌對(duì)于降低根系分泌物中有機(jī)酸質(zhì)量濃度具有顯著的作用。本研究結(jié)果與張志紅[13]等測(cè)定結(jié)果相似，研究表明，施用BOF香蕉根系分泌物中低分子量有機(jī)酸質(zhì)量濃度降低，且有機(jī)酸質(zhì)量濃度與防病效果變化呈相反趨勢(shì)[14-15]。

表2 不同處理根系分泌物中有機(jī)酸質(zhì)量濃度 Table 2 The contents of organic acids in root exudates in different treatments mg·L-1

2.3 生物有機(jī)肥對(duì)根系分泌物中氨基酸質(zhì)量濃度的影響

表3 不同處理根系分泌物中氨基酸質(zhì)量濃度 Table 3 The contents of amino acids in root exudates in different treatments μg·L-1

從表3可以看出，施肥對(duì)根系分泌物中氨基酸的質(zhì)量濃度和種類(lèi)均有影響。BOF處理中氨基酸種類(lèi)和總量最多，OF次之。施肥處理的磷酸絲氨酸、a-氨基丁酸和γ-氨基丁酸等17類(lèi)氨基酸質(zhì)量濃度均高于CK處理，?；撬帷⒐习彼?、3-甲基-組氨酸和鵝肌肽質(zhì)量濃度則相反，表明施用BOF和OF增加了氨基酸的種類(lèi)和總量。BOF處理中γ-氨基丁酸、β-丙氨酸、a-氨基丁酸、谷氨酸、肌肽、天冬氨酸和磷酸絲氨酸質(zhì)量濃度均顯著高于OF；BOF根系分泌物中主要氨基酸有磷酸絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、γ-氨基丁酸、乙醇氨和肌肽，其中磷酸絲氨酸和γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度顯著高于OF。以上結(jié)果表明，施用BOF后明顯提高根系分泌物中氨基酸質(zhì)量濃度，說(shuō)明BOF中添加的拮抗菌對(duì)根系分泌物中氨基酸的質(zhì)量濃度有顯著影響。

為明確香蕉根系分泌物中氨基酸組分與枯萎病抗性之間的關(guān)系，對(duì)根系分泌物中氨基酸組分與香蕉枯萎病的重要抗病性指標(biāo)—病情指數(shù)—進(jìn)行相關(guān)性分析(表3)，結(jié)果表明，香蕉病情指數(shù)與磷酸絲氨酸、絲氨酸、異亮氨酸質(zhì)量濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，與鵝肌肽呈極顯著正相關(guān)；與?；撬?、胱氨酸、羥賴(lài)氨酸、3-甲基-組氨酸質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，與天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、a-氨基丁酸、亮氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、賴(lài)氨酸質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均大于0.85，但未達(dá)到顯著相關(guān)水平。

3 討論

對(duì)多種土傳病害的研究結(jié)果表明，根系分泌物的細(xì)小變化都會(huì)導(dǎo)致包括土壤病原菌在內(nèi)的根際微生物區(qū)系的極大變化[16-17]，它是聯(lián)系植物和根際土壤微生物的重要媒介[18]。已有研究[19]表明，不同植物根系分泌物的氨基酸種類(lèi)與數(shù)量有明顯差異。張俊英等[20]研究大豆根系分泌物中氨基酸對(duì)根腐病菌生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，感病大豆品種根系分泌的主要氨基酸為精氨酸，抗病大豆品種根系分泌的氨基酸主要為天冬氨酸。潘凱和吳鳳芝[21]研究表明，根系分泌物中總氨基酸質(zhì)量濃度隨品種抗性的增加而降低，精氨酸、絲氨酸和賴(lài)氨酸的質(zhì)量濃度與品種對(duì)枯萎病的病情指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。韓麗梅等[22]研究結(jié)果表明，抗病品種根系分泌物中精氨酸比感病品種高1.02倍，感病品種根系分泌物氨基酸組分則對(duì)大豆根腐病病菌具有顯著的促進(jìn)作用。有研究結(jié)果表明，不同大豆品種根系分泌的有機(jī)酸種類(lèi)多少存在差異，而且同種有機(jī)酸的分泌量也因品種而異, 表現(xiàn)為感病品種的數(shù)量高于抗病品種[14]。這些研究結(jié)果[17,23]表明，根系分泌物與抗病性的關(guān)系主要體現(xiàn)在根系分泌物成分對(duì)根際微生物的影響。根系分泌物是影響土壤中病原菌生長(zhǎng)繁殖的重要因素，與土傳病害密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，生物有機(jī)肥不僅為植物提供了大量養(yǎng)分且改善了微生態(tài)環(huán)境[8]，還促進(jìn)了植物的生長(zhǎng)并提高了植物的抗病性，這與根系分泌物的改變有密切關(guān)系。由此可見(jiàn)，根系分泌物在植物的抗病作用中起著不可低估的作用。生物有機(jī)肥可減少香蕉枯萎病發(fā)生，與其影響香蕉根系分泌物有關(guān)，這為香蕉枯萎病減輕的原因提供了一定理論依據(jù)。但還應(yīng)深入研究有差異表達(dá)的氨基酸和有機(jī)酸在對(duì)香蕉枯萎病病原菌生長(zhǎng)的影響，以進(jìn)一步明確生物有機(jī)肥防治香蕉枯萎病的機(jī)制。

已在相關(guān)研究[20-21]中驗(yàn)證了絲氨酸、精氨酸對(duì)黃瓜枯萎病病菌的生長(zhǎng)發(fā)育有顯著的抑制作用，而苯丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和丙氨酸對(duì)黃瓜枯萎病病菌的生長(zhǎng)發(fā)育有明顯的促進(jìn)作用。本研究所得的相關(guān)性分析結(jié)果能否作為香蕉枯萎病抗性的鑒定指標(biāo)，需要進(jìn)一步檢驗(yàn)。

4 結(jié)論

綜上所述，本試驗(yàn)可以得出以下幾點(diǎn)結(jié)論：

（1）生物有機(jī)肥和有機(jī)肥可以有效防治香蕉枯萎病，防病效果分別達(dá)到55.4%和28.5%。

（2）生物有機(jī)肥比有機(jī)肥更明顯降低了各低分子量有機(jī)酸質(zhì)量濃度，且顯著降低了有機(jī)酸總量質(zhì)量濃度。

（3）生物有機(jī)肥和有機(jī)肥的施用都提高了根系分泌物中氨基酸的總量和種類(lèi)，但生物有機(jī)肥的效果更顯著。

（4）香蕉枯萎病病情指數(shù)與磷酸絲氨酸、絲氨酸、異亮氨酸質(zhì)量濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，與鵝肌肽質(zhì)量濃度呈極顯著正相關(guān)。

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