汪勇，高培峰#，趙新穎，2，屈鋒*

(1.北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081;2.北京市理化分析測試中心，北京 100089)

定量蛋白質(zhì)組學(xué)的絕對定量方法需要使用標準內(nèi)標肽，內(nèi)標肽的純度和穩(wěn)定性等性質(zhì)影響定量方法的準確度和精確度。同時，蛋白質(zhì)定量方法研究中也需要保證蛋白質(zhì)樣品的性質(zhì)穩(wěn)定和一致。由于多肽及蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性在很大程度上影響蛋白質(zhì)的定量研究，因此快速、有效地評價和表征樣品的穩(wěn)定性是定量蛋白質(zhì)組學(xué)深入研究應(yīng)該解決的問題之一，樣品穩(wěn)定性也是定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究必須關(guān)注的基本內(nèi)容。

血管緊張素II 是人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)物質(zhì)，對心血管功能穩(wěn)定、電解質(zhì)和體液平衡的維持、血壓調(diào)節(jié)等方面均有重要作用［1］。血管緊張素II 作為標準內(nèi)標肽和藥用多肽時，其純度、穩(wěn)定性是質(zhì)量優(yōu)劣的關(guān)鍵指標。血管緊張素II的檢測多采用高效液相色譜(HPLC)結(jié)合免疫化學(xué)方法［2］或放射性同位素檢測［3］。也有基于高效液相色譜法研究物理和化學(xué)因素(如保存條件、溫度、pH 值、緩沖溶液)對多肽穩(wěn)定性的影響［4］。相比HPLC，毛細管電泳(CE)方法速度快，分辨率高，所需樣品量少，已有多肽藥物［5］和生物樣品中血管緊張素及衍生物的分析報道［6］，與毛細管電泳相關(guān)的毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)［7-9］、毛細管電色譜(CEC)［10］方法也出現(xiàn)在一些多肽的分析中。

糖蛋白是生物體內(nèi)重要的功能蛋白，也是修飾蛋白質(zhì)組學(xué)的研究熱點。作為定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)，了解糖蛋白的穩(wěn)定性是其相關(guān)研究的基礎(chǔ)和前提。目前糖蛋白穩(wěn)定性的研究重點主要是利用分子動力學(xué)模擬和物理化學(xué)參數(shù)變化研究其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［11-13］。也有基于紫外光譜法針對特定生物體內(nèi)所提取的蛋白質(zhì)的含量變化進行穩(wěn)定性表征的研究報道［14］。利用毛細管電泳分析與糖有關(guān)的糖蛋白、寡糖和糖肽已有綜述報道［15，16］。

多肽和糖蛋白大多具有生物學(xué)活性，外界條件變化易于影響多肽和糖蛋白的結(jié)構(gòu)，引起穩(wěn)定性改變和分子的荷質(zhì)比變化。毛細管電泳法可快速表征多肽和糖蛋白的分子的荷質(zhì)比差異。在不同的外界條件下(如樣品存放時間、溫度、溶液pH)，多肽和糖蛋白的電泳圖譜的出峰個數(shù)、出峰時間以及峰形等參數(shù)可指示分子的表面電荷性質(zhì)甚至分子結(jié)構(gòu)的變化，從而可用于表征多肽和糖蛋白的穩(wěn)定性。盡管已有較多針對多肽和糖蛋白的相關(guān)分析報道，但針對兩類樣品穩(wěn)定性和影響因素的研究還沒有較系統(tǒng)的報道。本文以市售血管緊張素II和植物血球凝集素、牛凝血酶、人凝血酶、辣根過氧化物酶4種糖蛋白為多肽和糖蛋白模式分子，利用毛細管電泳分析方法表征其穩(wěn)定性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ 毛細管電泳系統(tǒng)，配備紫外(UV)檢測器(美國Beckman Coulter 公司)。Agilent 7100毛細管電泳系統(tǒng)，配備二極管陣列檢測器(DAD 檢測器)(美國Agilent 公司)。

血管緊張素II(Ang II)是人工合成的DRVYIHPF 八肽，pI 6.94，純度≥95%，購自上海強耀生物科技有限公司。植物血球凝集素(PHA，pI 5.4～6.5)、牛凝血酶(B-Thr，pI 5～8)購自Sigma Aldrich公司，人凝血酶(H-Thr，pI 5～8)購自Enzo Life Sciences 公司，辣根過氧化物酶(HRP，pI 3～9)購自ROCHE 公司。

硼酸、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、檸檬酸和檸檬酸鈉(北京化工廠)，硼砂和磷酸氫二鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，磷酸氫二鈉(北京化學(xué)試劑公司)，Tris(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)，上述試劑均為分析純，實驗用水均為蒸餾水。

熔融石英毛細管購自凱利奧拉色譜分析(邯鄲)有限責任公司。涂層毛細管購自河北邯鄲開發(fā)區(qū)奧泰克生物科技有限公司。

1.2 毛細管電泳實驗條件

多肽分析條件:Beckman P/ACE MDQ 毛細管電泳系統(tǒng)，進樣壓力3.45 kPa(0.5 psi)，進樣時間5 s;正向20 kV 分離，檢測波長為280 nm;樣品溶液用稀釋后的電泳緩沖液配制。熔融石英毛細管(有效長度/總長:40 cm/50.2 cm，內(nèi)徑:75μm)，兩次實驗間和實驗結(jié)束后，依次用0.1 mol/L NaOH和H2O在172.37 kPa(25 psi)下沖洗5 min。毛細管不用時需將兩端水封后置于室溫下保存。

糖蛋白分析條件:Agilent 7100毛細管電泳系統(tǒng)，進樣壓力5 kPa，進樣時間5 s;B-Thr的分析電壓為-10 kV，其余3種糖蛋白均為-20 kV;檢測波長為195 nm;樣品溶液用0.2 mol/L(pH 7.4)硼酸鹽緩沖液配制。涂層毛細管(有效長度/總長:25 cm/33.5 cm，內(nèi)徑:75μm)，新毛細管在使用前分別用20 mmol/L H3PO4和H2O 各沖洗10 min，兩次實驗之間和實驗結(jié)束后，依次用20 mmol/L H3PO4和H2O 沖洗5 min，毛細管不用時需將兩端水封后置于4℃冰箱中保存。

2 結(jié)果與討論

對人工合成的Ang II 進行純度和穩(wěn)定性分析。優(yōu)化樣品分析所需樣品濃度、電泳緩沖液、樣品溶液pH和離子強度等條件，并對樣品的純度進行表征，對保存溫度和時間對樣品溶液穩(wěn)定性的影響進行討論。分別考察了PHA、B-Thr、H-Thr和HRP 這4種糖蛋白在毛細管中的吸附性，在電泳中的荷電性質(zhì)及遷移，以及保存溫度和時間對4種糖蛋白樣品溶液穩(wěn)定性的影響。

2.1 Ang II 分析

2.1.1 樣品濃度選擇

準確稱取Ang II 樣品溶于水中，配制成60 g/L的母液，實驗時稀釋到所需濃度?？疾鞓悠窛舛扰c峰面積之間的線性關(guān)系，如圖1所示，Ang II 在0.03～0.24 g/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。后續(xù)實驗中所用質(zhì)量濃度均為0.06 g/L，該濃度下樣品的吸收值可滿足對樣品峰的觀察和對比。

2.1.2 電泳緩沖液對分離的影響

電泳緩沖液種類和pH 是決定分離效果的關(guān)鍵因素之一。實驗中考察了5種不同的緩沖體系:硼酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、PBS 緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(配比見表1)對樣品分析的影響(如圖2a)。

圖1 Ang II 樣品的電泳圖及其峰面積與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系Fig.1 Electropherograms and linearity of the peak area and mass concentration of Ang II

圖2 (a)緩沖液種類、(b)硼酸鹽緩沖液的pH、(c)樣品溶液的pH和(d)樣品溶液中離子強度對分離的影響Fig.2 Effects of(a)buffer type，(b)buffer pH，as well as(c)pH and(d)ionic strength of Ang II sample solution on separation

不同緩沖體系導(dǎo)致AngⅡ的遷移差異及負峰的出現(xiàn)。比較電泳圖中樣品峰的峰高和峰形，發(fā)現(xiàn)使用硼酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、PBS緩沖液和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液時，樣品峰的峰形尖銳，峰高值大。而含有磷酸鹽的后3者緩沖體系的電流值明顯高于硼酸鹽緩沖體系，故后續(xù)實驗選擇硼酸鹽緩沖液為電泳緩沖液?？疾炝瞬煌琾H的緩沖液對目標峰和雜質(zhì)峰的靈敏度和分離度的影響(圖2b)，可見pH 為8.7和9.0時雜質(zhì)峰的檢測最靈敏，且與目標峰分離度較好，對目標物的檢測干擾最小，因此后續(xù)實驗選擇pH 9.0的電泳緩沖液。

表1 實驗用緩沖液及其濃度和配比Table 1 Buffer types，concentrations and ratios used in the experiments

2.1.3 樣品溶液pH和離子強度對分離的影響

電泳過程中，待測樣品會在低電導(dǎo)樣品溶液與高電導(dǎo)電泳緩沖液的界面處發(fā)生堆積效應(yīng)產(chǎn)生富集作用。當電泳緩沖液保持恒定時，樣品溶液的pH和離子強度會對目標峰與雜質(zhì)峰的分離產(chǎn)生影響。

Moring 等［17］的研究表明，樣品溶液濃度為電泳緩沖液濃度的1/10時，樣品的濃縮效果最好。故在pH 9.0硼酸鹽緩沖液(0.2 mol/L)為電泳緩沖液時，以稀釋的不同pH的硼酸鹽緩沖液(0.02 mol/L)配制樣品溶液，考察樣品溶液pH 值對分離的影響。結(jié)果表明，不同樣品溶液pH 導(dǎo)致目標峰面積有所差異，但遷移時間以及目標峰與雜質(zhì)峰的分離度基本不變(圖2c)。

同樣，樣品溶液中離子強度較低也可使樣品中組分產(chǎn)生更好的濃縮效果，而增加離子強度則使檢測靈敏度降低。由圖2d 可見，在相同樣品濃度溶液中加入NaCl 時，NaCl 濃度增大使樣品中目標峰和雜質(zhì)峰均展寬，且峰面積降低，目標峰與雜質(zhì)峰的分離度也降低。說明對樣品進行純度分析時，樣品溶液中的離子強度或鹽濃度較大不利于提高目標峰和雜質(zhì)峰的分離度，實際樣品的純度檢測應(yīng)在低鹽條件(＜50 mmol/L NaCl)下進行。

綜合考慮上述影響因素，保持目標峰與雜質(zhì)峰的分離度最好，且目標峰檢測靈敏度高的優(yōu)化條件為:以0.2 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 8.7或9.0)為電泳緩沖液，以稀釋10倍的電泳緩沖液(0.02 mol/L)配制樣品。

2.1.4 樣品的純度分析

考慮到實驗中電滲流和實驗條件的波動對峰面積值的影響，以目標峰和雜質(zhì)峰的峰面積及校正的峰面積(峰面積/遷移時間)表示目標峰和雜質(zhì)峰的量。利用峰面積歸一化法，分別以目標峰面積與總峰面積、校正的目標峰面積與總校正峰面積的比值表示樣品的相對純度。

對0.06 g/L的Ang II 重復(fù)測定3次，測得樣品的純度值分別為:91.40%/88.76%(峰面積比值/校正峰面積比值)、89.09%/89.37%和90.83%/91.08%。兩種計算方法測得樣品純度的平均值分別為90.44%(RSD 1.09%)和89.74%(RSD 1.09%)，兩種方法之間存在約0.7%的數(shù)值差異，說明本實驗中的實驗條件穩(wěn)定，實驗重復(fù)性較好。但所測結(jié)果與商品供貨商標示的純度(≥95%)有明顯差異。因供貨商提供的驗證報告結(jié)果為HPLC 分析圖的峰面積歸一化處理所得，說明毛細管電泳方法與HPLC的測定結(jié)果表示的純度值存在的差異約在4.56%～5.26%之間。

2.1.5 存儲溶液pH和存儲溫度對穩(wěn)定性的影響

使用0.02 mol/L的pH 7.4的硼酸鹽緩沖液配制Ang II 樣品，將配好的樣品分為3份，分別置于20℃、4℃和-20℃下保存不同時間。統(tǒng)計各樣品的目標峰、雜質(zhì)峰的校正峰面積，比較樣品測定的純度值變化。

圖3 存儲溫度和時間對Ang II 穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of storage temperature and time on the stability of Ang II

由圖3可知，溶液狀態(tài)的Ang II 在不同的放置溫度下，其純度值的變化程度不同，溫度越低，純度值變化越小。放置溫度為20℃時，Ang II的純度值下降較快，24 h 時已降至90%以下。而低溫條件(4℃和-20℃)下，Ang II的純度值變化較小，放置48 h 內(nèi)，二者均保持在91%以上。4℃與-20℃相比，4℃保存時不需對樣品進行反復(fù)凍融，使用更方便。故Ang II 樣品溶液較好的保存條件為pH 7.4緩沖液中、4℃下放置，該條件下，Ang II 可在48 h 內(nèi)保持良好穩(wěn)定性。

2.2 糖蛋白分析

HRP(40 kDa)是植物辣根中存在的糖蛋白酶類，是酶聯(lián)免疫技術(shù)中常用的酶之一。凝血酶(34 kDa)是由凝血酶原形成的蛋白質(zhì)水解酶，是凝血過程中催化血纖蛋白原水解的酶。H-Thr 是通過重組技術(shù)獲得，B-Thr 是從牛血漿中提取而來。PHA(115 kDa)是一類具有特異糖結(jié)合活性的糖蛋白，通過細胞膜上特定的糖基識別可區(qū)別細胞的類型和反映細胞在分化、成熟和腫瘤細胞性變(性質(zhì))中的變化，是重要的細胞識別試劑。以上蛋白質(zhì)都是生物學(xué)中具有重要功能和應(yīng)用的糖蛋白。

2.2.1 糖蛋白的吸附性

蛋白質(zhì)通常在熔融石英毛細管內(nèi)壁存在一定的吸附性，因此考察了4種糖蛋白在毛細管內(nèi)的吸附性質(zhì)。結(jié)果表明，4種糖蛋白在毛細管內(nèi)壁的吸附都很強，在電泳過程中幾乎不出峰或峰形嚴重扭曲。因此選擇可抑制吸附的涂層毛細管進行分析。

2.2.2 糖蛋白的檢測

因涂層管中的電滲流很弱，故所施電壓主要影響蛋白質(zhì)自身的電泳遷移速率。使用硼酸鹽(pH 8.7)電泳緩沖液，正向電壓分離時，40 min 內(nèi)在負極檢測端均未檢測到4種糖蛋白。而采用負向電壓時，在正極檢測端可檢測到4種糖蛋白，說明4種蛋白質(zhì)在溶液中均表面帶凈負電荷。由1.1節(jié)可知，所購4種糖蛋白樣品標示的pI 值均不是單一值，而是處于3～9之間。上述實驗結(jié)果進一步說明所購4種蛋白質(zhì)的等電點均低于8.7。此外，H-Thr和HRP 電泳時出現(xiàn)單一峰，而B-Thr和PHA 則出現(xiàn)多重峰，因此認為后兩者可能存在多種蛋白質(zhì)的亞型或變體結(jié)構(gòu)。

2.2.3 分析條件優(yōu)化

緩沖液的選擇考察了硼酸鹽緩沖液(0.2 mol/L)、磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L)和Tris-HCl 緩沖液(0.1 mol/L)對分離的影響。Tris-HCl 緩沖液中，H-Thr、B-Thr 以及HRP均不出峰，PHA 多峰間分離度極差，只出一個包峰;磷酸鹽緩沖液中，4種糖蛋白分析時基線不平，出峰雜亂，且B-Thr和PHA的多峰之間分離度很低;使用硼酸鹽緩沖液，PHA和B-Thr的多峰間分離度較高，且H-Thr和HRP的峰形較好，響應(yīng)值較高。故實驗中選用硼酸鹽溶液作為電泳緩沖液。

緩沖液pH的選擇因涂層毛細管的內(nèi)表面涂層易受強酸或強堿溶液的破壞，且實驗中4種糖蛋白均沒有確定的等電點，除HRP 外，其余3種蛋白呈現(xiàn)出5～8的等電點范圍，因此，考察了中性pH緩沖液(pH 7.4、7.8、8.2、8.7)的影響。圖4的結(jié)果表明，pH 7.4時，4種糖蛋白的響應(yīng)值最低，糖蛋白B-Thr和PHA的多峰間分離度也最差;而pH 8.7時，4種糖蛋白的出峰較好，B-Thr 以及PHA的多峰得到很好分離，成分單一的H-Thr 以及HRP 峰形較好，且響應(yīng)值較高。pH 7.8和8.2的結(jié)果介于二者之間。因此后續(xù)實驗選用pH 8.7的硼酸鹽緩沖液。

圖4 緩沖液pH 對糖蛋白分離的影響Fig.4 Effect of running buffer pH on glycoprotein separation

分離電壓的選擇由圖4可見，4種糖蛋白中除HRP 外，其余3種糖蛋白的峰形明顯較差。為此考察了電壓對分離的影響。對H-Thr、HRP 以及PHA 選擇了-15，-20，-25 kV 3個電壓。因BThr 出峰數(shù)較多，為增加其分辨率，選擇了較低的-10，-15，-20 kV 3個電壓。在-25 kV 電壓下，蛋白質(zhì)樣品的遷移時間明顯較快，有利于單一峰形蛋白質(zhì)的快速分析(見圖5中HRP和H-Thr)。但對含有多峰的PHA和B-Thr 蛋白，隨著電壓的升高，多峰間的分辨率明顯降低(見圖5中PHA和BThr)。此外，高電壓下電泳速度加快的同時，蛋白質(zhì)樣品的檢測靈敏度有所降低。在-20 kV 分離時，H-Thr、HRP 以及PHA的分離效果較好，但B-Thr的多峰之間不能有效分離。而在-10 kV 時，B-Thr 多峰間的分離得到改善。因此，后續(xù)表征蛋白質(zhì)穩(wěn)定性時，對H-Thr，HRP 以及PHA 選擇-20 kV 電壓，而對B-Thr 選擇-10 kV 電壓。

2.2.4 糖蛋白的穩(wěn)定性

將0.2 mol/L(pH 7.4)硼酸鹽緩沖液配制的蛋白質(zhì)樣品分為3份，分別置于20℃、4℃和-20℃下放置不同時間。比較樣品的電泳圖變化，圖6的結(jié)果顯示，48 h 內(nèi)，3種保存溫度下，4種糖蛋白溶液的電泳圖沒有明顯改變，說明樣品溶液穩(wěn)定性良好。當樣品保存時間大于一周且小于四周，隨著時間的增加，3種溫度對樣品的穩(wěn)定性存在明顯影響:在-20℃保存時，4種糖蛋白電泳圖相對穩(wěn)定，峰形、出峰個數(shù)隨時間變化基本不變;在4℃保存時，H-Thr的峰形變化較大，難以確定其峰高或峰面積，但其余3種糖蛋白的電泳圖基本不變，受保存時間影響不大;在20℃保存時，除HRP 仍基本保持穩(wěn)定外，其余3種糖蛋白的電泳圖均出現(xiàn)明顯變化:HThr的峰高明顯降低，糖蛋白B-Thr和PHA的峰形和峰位置隨時間增加而改變，一些峰降低或消失，但又有新形態(tài)的峰出現(xiàn)。放置時間大于兩周且小于四周，HRP 仍保持相對穩(wěn)定，而H-Thr的峰幾乎消失;PHA和B-Thr的出峰數(shù)、峰高及遷移時間與新配樣品相比，也出現(xiàn)顯著的變化。

圖5 分離電壓對糖蛋白分離的影響Fig.5 Effect of voltage on glycoprotein separation

圖6-Ⅰ 保存溫度和時間對糖蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.6-Ⅰ Effects of storage temperature and time on the stability of glycoproteins

圖6-Ⅱ 保存溫度和時間對糖蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.6-Ⅱ Effects of storage temperature and time on the stability of glycoproteins

3 結(jié)論

多肽和蛋白質(zhì)等生物樣品的穩(wěn)定性對后續(xù)實驗研究非常重要。為了保證對多肽和蛋白質(zhì)等樣品的定量分析，對其進行高效、快速的穩(wěn)定性考察和表征非常必要。本文所用的Ang II和4種糖蛋白的穩(wěn)定性均較好，配制的樣品溶液在48 h 內(nèi)可保持穩(wěn)定。毛細管電泳方法具有高效、快速、低成本優(yōu)勢，適合用于快速表征和評價多肽和蛋白質(zhì)樣品的穩(wěn)定性，以及研究影響穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，且特別適合價格昂貴或來源稀少的生物樣品的表征和評價。

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