王國娟，張鍇*，何錫文，張玉奎，3

(1.南開大學藥物化學生物學國家重點實驗室，天津 300071;2.南開大學化學學院，天津 300071;3.中國科學院大連化學物理研究所，遼寧大連 116023)

組蛋白翻譯后修飾是一類重要的表觀遺傳學密碼［1］，它參與細胞中DNA 復制、基因轉錄、DNA 損傷修復、染色體凝聚等重要的生物過程，不僅與細胞的分化和發(fā)育密切相關，也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切聯(lián)系［2-5］。越來越多的證據(jù)表明:組蛋白翻譯后修飾將成為新一代重要的疾病標志物和藥物調控靶點［6-8］。目前已經報道了組蛋白60多個氨基酸殘基上的至少11種翻譯后修飾形式，包括乙?；⒓谆?、丙酰化、丁酰化、磷酸化、泛素化、蘇素化等［9，10］。由于組蛋白翻譯后修飾種類繁多，且隨著細胞生理活動而動態(tài)變化，因此對傳統(tǒng)生物分析技術提出了挑戰(zhàn)。近年來，隨著高分離能力的色譜技術與高精度、高分辨率質譜技術的迅速發(fā)展，基于質譜技術的蛋白質組學方法已成為組蛋白翻譯后修飾鑒定和定量分析的重要手段。

目前，基于質譜技術的定量蛋白質組學策略主要有:無標記的質譜定量和基于同位素標記的質譜定量方法。Jensen 等［11］發(fā)展了基于分析和計算機策略的無標記質譜法，這一方法可以在多肽水平上獲得所有4個核心組蛋白翻譯后修飾的相對量。Mann 等［12］發(fā)展了SILAC 方法(stable isotope labeling by amino acids in cell culture)，將輕、重同位素標記的氨基酸分別加入不同的細胞培養(yǎng)基中，在細胞生長代謝過程中完成對不同樣本蛋白質的同位素標記。再將不同標記的樣品按一定比例混合，平行處理后，進入質譜檢測。通過生物信息學分析，對比輕、重同位素標記的、序列相同肽段的豐度，可以得到不同狀態(tài)下蛋白質修飾的相對定量關系。Bonenfant 等［13］利用SILAC 法相對定量了HeLa 細胞由S期到G2/M 期多種組蛋白修飾的變化，發(fā)現(xiàn)有絲分裂是細胞周期中多種修飾發(fā)生動態(tài)變化的時期。Garcia 等［14］建立了體外化學衍生同位素標記方法，改進了酶解肽段的疏水性，增加序列覆蓋率，可以用于組蛋白修飾的定量分析。

本文在對組蛋白翻譯后修飾研究中發(fā)現(xiàn)了一些氨基酸序列相同、同種修飾位于不同殘基位點的多肽組，這些多肽具有非常相近的色譜行為，通常同時從液相色譜柱上流出進入質譜。由于它們的質荷比(m/z)完全相同，因此在一級質譜中難以分辨，作為同一個母離子被選取并進行碎片裂解，這導致二級碎片的復雜性增加，難以鑒定。本文采用液相色譜與質譜技術聯(lián)合蛋白質信息學方法，對Hela 細胞組蛋白H3賴氨酸27位和36位上的甲基化和二甲基化修飾的定量分析進行了探討。

1 實驗部分

1.1 主要試劑

改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素(均購于Thermo Scientific 生物化學制品(北京)有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS 緩沖液):0.2 g磷酸二氫鉀(KH2PO4)、0.2 g 氯化鉀(KCl)、1.14 g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、8.0 g 氯化鈉(NaCl)(均購于Bio Basic Inc.)，溶解在500 mL 高純水(Millipore純水機制備)中，pH 調至7.4;乙腈和水(購于Fisher Scientific，Pittsburgh，PA，USA)，三氟乙酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，測序級胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)，μ-C18 ZipTip(Millipore，Bedford，MA，USA)。

1.2 細胞培養(yǎng)及組蛋白提取

配制含有10%(v/v)胎牛血清及1%(v/v)雙抗(青霉素、鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基。取出凍存的Hela 細胞，快速置于37℃水浴中復蘇，加入上述配好的培養(yǎng)基，將Hela 細胞均勻接種在康寧培養(yǎng)皿(d=10 cm)中，放置在37℃下、含有5%(v/v)CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，大約72 h 后，待細胞長至80%滿時，收集細胞進行組蛋白提取。

組蛋白提取詳細步驟按文獻［15］報道的方法進行。主要步驟如下:用預冷的含有5 mmol/L 丁酸鈉的PBS 溶液沖洗Hela 細胞兩次，每次10 min，離心機轉速設置為300 g;加入1 mL 蛋白提取緩沖溶液(Triton X-100 Extraction Buffer，TEB):0.5%(v/v)

Triton X-100、2 mmol/L 苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、0.2 g/L 疊氮化鈉(NaN3)，置于冰上振蕩10 min 以裂解細胞，離心，棄去上清液;在殘渣中加入0.2 mol/L H2SO4溶液(約400μL)提取組蛋白;離心并轉移上清液到新的1.5 mL 離心管中，向其中逐滴加入50%(v/v)的三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)水溶液，振蕩數(shù)次，在冰上放置30 min 使沉淀完全，然后離心棄去上清。最后分別用在4℃下預冷的0.1%(v/v)濃鹽酸/丙酮溶液和在-20℃下冰冷的100%丙酮沖洗沉淀，離心干燥獲取組蛋白。

1.3 組蛋白樣品前處理

利用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將提取的組蛋白混合樣品分離。切取目標組蛋白膠條，進行膠內酶解［16］:蛋白凝膠條帶經脫色、切碎、洗滌、干燥后置于含0.2μg 胰蛋白酶的50 mmol/L的碳酸氫銨溶液(pH=8.0)中，37℃下酶解過夜。提取酶解多肽，離心干燥。最后，多肽經μ-C18 ZipTip 除鹽處理，用于后續(xù)液相色譜-質譜分析。

1.4 HPLC/MS-MS 分析及數(shù)據(jù)搜索

采用nano-HPLC/LTQ-orbitrap 質譜儀(Thermo，CA)進行樣品分析［17］。將酶解后的多肽溶解在10μL的緩沖溶液A(0.1%(v/v)甲酸水溶液)中，取2μL 溶解后的多肽樣品注射到Nano-HPLC 系統(tǒng)(Eksigent Technologies，Dublin，CA)中進行分離。自制毛細管柱(100 mm×75μm)填料為Jupiter C12(粒徑4μm，孔徑9 nm，Phenomenex，St.Torrance，CA)。液相色譜流動相由初始5%的緩沖溶液B(含0.1%(v/v)甲酸、95%(v/v)乙腈的水溶液)在120 min 內線性變化至95%的緩沖液B。液相色譜分離后的多肽樣品經由電噴霧離子源Nano-ESI 引入質譜儀進行分析。質譜儀采用data-dependent 模式，一次MS 掃描后進行20次的二級質譜碎片分析。一級質譜的掃描范圍為m/z 350～2000;采用collisionally activated dissociation(CAD)碎片裂解模式，歸一化能量為35%;全掃描的Automatic gain control(AGC)值設為1E6。所得到的質譜數(shù)據(jù)利用Mascot軟件在NCBInr 數(shù)據(jù)庫進行搜索［18］。

2 結果與討論

2.1 組蛋白酶解多肽的鑒定

從Hela 細胞中提取出組蛋白后，采用SDSPAGE 將組蛋白混合物有效分離，酶解成多肽后，采用液相色譜與質譜聯(lián)用儀檢測，借助于Mascot 軟件搜索和質譜數(shù)據(jù)解析，整體考察了Hela 細胞組蛋白H3上的翻譯后修飾圖譜。根據(jù)Mascot 數(shù)據(jù)檢索報告，結合手工分析，對鑒定到的組蛋白H3的多肽序列、修飾位點和鑒定到的數(shù)量進行了統(tǒng)計(見表1)。鑒定結果表明，Hela 細胞組蛋白H3上修飾形式復雜，一段多肽上可能有一個、兩個，甚至三個氨基酸殘基上存在修飾。二級質譜譜圖數(shù)量的差異進一步表明:這些含有修飾的多肽豐度存在較大不同。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列27～40的肽段上賴氨酸K27和K36位點上修飾很豐富，且Kme2-SAPATGGVKmeKPHR和KmeSAPATGGVKme2KPHR的m/z 相同(都是738.44)，從液相色譜中同時流出，具有相同的保留時間，因此對它們的鑒定和定量需要進一步分析。

表1 Hela 細胞組蛋白H3多肽鑒定的統(tǒng)計Table 1 A list of all identified tryptic H3 peptides in Hela cells

2.2 H3K27和K36甲基化與二甲基化修飾的鑒定

通過分析修飾肽段的二級質譜碎片(圖1)，并將b、y 離子的測量值與多肽序列碎片理論值進行對比，推測二級質譜碎片可能是由兩組碎片峰疊加組成的。通過b、y 離子的歸屬分析，進一步確認了單甲基化與二甲基化修飾的修飾位點。圖1中紅色所示y5離子m/z 值為679.44，y4離子m/z 為537.33，二者相差142.1，恰好等于賴氨酸殘基(m/z 128.2)與甲基化修飾(m/z 14)之和的質荷比，由此可知K36帶有甲基化修飾;圖1中藍色所示y5*離子的m/z 是693.45，它與y4離子的m/z 差值為156.1，剛好等于賴氨酸殘基(m/z 128.2)與二甲基化修飾(m/z 28)之和的質荷比，由此可以確定K36帶有二甲基化修飾。采用同樣方法可以鑒定K27上的修飾。另外，根據(jù)二級質譜圖中，二者對應的b10、b11、b13、y2、y3、y4離子的質荷比相等，而b3、b5、y5、y7、y8、y9、y11、y12、y13離子的質荷比相差14，可以進一步驗證這一肽段序列上兩種修飾的類型和位點。例如y8的m/z 為892.61，根據(jù)其他碎片峰的信息，綜合判斷的多肽為:“GGVKmeKPHR”;而y8*(m/z 906.65)為“GGVKme2KPHR”，二者相差一個甲基的質荷比(m/z 14)。

2.3 H3K27和K36的甲基化與二甲基化修飾的相對豐度分析

圖1 賴氨酸27和賴氨酸36位點修飾肽段(amino acid，aa 27-40)的二級質譜圖Fig.1 MS/MS spectrum of mixed peptide(aa 27-40)with post-translational modifications(PTMs)at K-27 and/or K-36

由于Kme2SAPATGGVKmeKPHR和KmeSAPATGGVKme2KPHR 在色譜分離時同時出峰，一級質譜峰重疊在一起，且具有相同的質荷比，無法根據(jù)它們一級譜圖對應峰的強度或者二級碎片譜圖的數(shù)量來定量分析。因此考察了它們混合二級圖譜中不同碎片的豐度。在二級質譜圖上，二者的碎片離子b3、b5、y5、y7、y8、y9、y11、y12、y13的m/z 相差14，提取這幾對離子中豐度相對最高的3組碎片離子y8、y9、y11進行對比分析?？梢钥闯?Kme2SAPATGGVKmeKPHR 對應的離子y8、y9、y11和KmeSAPATGGVKme2KPHR 對應的y8*，y9*，y11*的相對豐度的比值分別為1.00、0.83和0.92(見表2)，平均比值是0.92。由此，我們可以分析這兩條多肽對兩個修飾位點的貢獻。

表2 肽段(aa 27-40)上不同修飾的最強離子豐度表Table 2 List of three most intense ions of distinct peptide species(aa 27-40)

3 結論

本文利用液相色譜與串聯(lián)質譜聯(lián)用技術結合蛋白質信息學分析手段，考察了Hela 細胞組蛋白H3的翻譯后修飾。通過二級質譜碎片解析，對質荷比相同而修飾位點不同的肽段進行了圖譜解析，確定了多肽序列和修飾位點;利用二級碎片離子的豐度比，確定了修飾的豐度差異。對復雜樣品中多肽修飾的定性定量分析進行了探索性的研究。

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