周愿，單亦初，張麗華*，張玉奎

(1.中國科學院大連化學物理研究所，中國科學院分離分析化學重點實驗室，國家色譜研究分析中心，遼寧大連 116023;2.中國科學院大學，北京 100039)

對細胞、組織和整個生物體的表達蛋白質進行定量分析是后基因時代面臨的主要挑戰(zhàn)之一［1］。蛋白質組定量分析可以分為相對定量和絕對定量［2］。相對定量是研究不同情況下同一蛋白質組樣品組成含量的變化，如細胞受到刺激前后蛋白質表達的差異;絕對定量是研究樣品中目標蛋白質的具體量，如拷貝數(shù)或濃度。

早期的蛋白質組定量主要利用雙向凝膠電泳或雙向差異凝膠電泳來實現(xiàn)。雖然該方法對蛋白質分離具有較高的分辨率，然而無法對疏水、低豐度和翻譯后修飾蛋白質進行定量。近年來基于液相色譜-串級質譜聯(lián)用的方法得到了快速發(fā)展，已成為蛋白質組定量的主流技術。該方法可以分為無標記定量法和穩(wěn)定同位素標記定量法。其中，基于穩(wěn)定同位素標記的蛋白質組定量方法可以在不同步驟實現(xiàn)樣品混合，可以同時實現(xiàn)多重標記及消除色譜-質譜聯(lián)用分析過程中不穩(wěn)定性帶來的定量誤差等優(yōu)點，已成為定量蛋白質組學研究中最常用的方法。

根據(jù)同位素引入的方式，基于穩(wěn)定同位素標記的蛋白質組定量方法可以分為代謝標記法、化學標記法和酶解標記法。采用不同方法，標記同位素的樣品在不同步驟混合;越早混合，樣品預處理步驟引入的誤差越小，定量的準確度越高。進行相對定量時，采用代謝標記法則樣品在細胞水平混合;采用化學標記法則樣品在蛋白質或者肽段水平混合;采用酶解標記法則樣品在肽段水平混合。進行絕對定量時，樣品在蛋白質或者肽段水平混合(見圖1)。本文結合近期發(fā)表的文獻，對基于穩(wěn)定同位素標記的蛋白質組定量方法進行綜述和評述。

圖1 基于質譜的蛋白質組學定量方法及實驗流程(改編自文獻［2，3］)Fig.1 Mass spectrometry-based quantitative proteomics methods and workflows(adapted from references［2，3］)

1 基于穩(wěn)定同位素標記的相對定量方法

基于穩(wěn)定同位素標記的蛋白質組相對定量方法分為基于一級質譜(如細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記(SILAC)［4］、二甲基化標記［5］等)和串級質譜(如等重同位素標記相對與絕對定量方法(iTRAQ)［6］、等重肽末端標記方法(IPTL)［7］等)的定量方法。前者通過比較輕重標記的樣品在一級質譜的峰強度/峰面積實現(xiàn)蛋白質組的相對定量分析;后者通過比較樣品在二級或者三級質譜的特征性碎片離子的峰強度實現(xiàn)蛋白質組的相對定量分析。

1.1 基于一級質譜的相對定量方法

適用于基于一級質譜的相對定量方法的穩(wěn)定同位素標記試劑種類多、數(shù)據(jù)分析軟件對其的支持較好，因此目前得到了較為廣泛的使用。常用的方法有SILAC、15N 標記［8］、二甲基化標記、質量差異同位素標記相對與絕對定量標簽(mTRAQ)標記［9］、18O標記［10］等。其中SILAC和15N 為代謝標記;二甲基化標記和mTRAQ 為化學標記;18O 標記為酶解標記。

1.1.1 基于代謝標記的相對定量方法

代謝標記是指在細胞或生物體成長過程加入含有穩(wěn)定同位素標記的培養(yǎng)基，完成細胞或生物體標記的方法。常見的代謝標記方法有SILAC和15N 標記法，尤其SILAC 法使用更為廣泛。該方法是在細胞培養(yǎng)過程中加入穩(wěn)定同位素標記的必需氨基酸，如賴氨酸(K)和精氨酸(R)，使得每條肽段相差的質量數(shù)恒定。與15N 方法相比，由于肽段的質量差異數(shù)與氨基酸種類和數(shù)目無關，因此簡化了相對定量分析的難度。

為了解決SILAC 法只適用于細胞樣品分析的不足，發(fā)展了培養(yǎng)基衍生同位素標簽(CDITs)［11］、同位素標記蛋白質組(SILAP)［12］和超級SILAC(super-SILAC)［13］等方法。這些方法采用穩(wěn)定同位素標記的細胞樣品作為內(nèi)標，通過與不同狀態(tài)的組織樣品混合，實現(xiàn)了組織樣品蛋白質組表達的差異分析。此外，為了便于考察在體內(nèi)蛋白質組的動態(tài)變化，如蛋白質的生成和降解，脈沖SILAC(pulsed SILAC)［14，15］(見圖2)應運而生。該方法首先將經(jīng)過不同刺激的細胞在輕標記的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，之后分別轉入中標記和重標記的培養(yǎng)液中培養(yǎng);通過比較中標記和重標記的比值，實現(xiàn)不同刺激條件下蛋白質表達量的差異分析?；驅⒃谳p標記培養(yǎng)液中培養(yǎng)的細胞分成兩份，分別接受不同的刺激，并分別進行中標記和重標記;再通過比較中、重標記的比值，實現(xiàn)不同刺激條件下蛋白質表達量的差異分析［15］。

為降低同位素峰的干擾對定量的影響，基于一級質譜的定量方法通常要求MS1的質量差大于4 Da。近期，Hebert 等［16］提出了中子編碼SILAC 法(NeuCode SILAC);利用13C、15N和2H 同位素因核結合能而導致的質量虧損，通過高分辨(分辨率(Rs)＞200000)質譜對這細微的差異進行分析，實現(xiàn)了采用不同穩(wěn)定同位素標記的兩種蛋白質組樣品的相對定量分析。該方法理論上可以實現(xiàn)多重樣品的標記，但是對質譜的分辨率要求極高。

圖2 脈沖SILAC 原理示意圖［14，15］Fig.2 Principle of pulsed SILAC［14，15］

雖然基于代謝標記的方法在定量蛋白質組領域得到了極為廣泛的使用，但是仍有一些不足:1)成本較高;2)難以用于人的組織樣品及體液的分析;3)同位素標記氨基酸的使用會導致標記蛋白質的表達不同于非標記蛋白質的表達［17］;4)在細胞培養(yǎng)過程中存在精氨酸向脯氨酸轉化的現(xiàn)象。

1.1.2 基于化學標記的相對定量方法

除代謝水平標記外，通過體外化學標記引入同位素是一種非常有價值的蛋白質組相對定量方法;適用于細胞、體液、組織等多種樣品分析。現(xiàn)有的化學標記試劑多數(shù)通過與氨基或巰基反應引入穩(wěn)定同位素。最常用的是基于N-羥基琥珀酰胺(NHS)化學和還原胺反應，如mTRAQ和二甲基化標記，其中二甲基化標記使用更為廣泛。

Hsu 等［5］發(fā)展的二甲基化標記是利用甲醛和氰基硼氫化鈉組合標記肽段所有的活性氨基。該方法具有反應條件溫和、快速、高效、無明顯副反應、同位素試劑種類多、價格低廉等優(yōu)點。Raijmakers 等［18］使用預柱進行在線標記，不僅減少了標記時間，而且降低了人為因素帶來的誤差，提高了定量的準確性和精密度。該課題組［19］還實現(xiàn)了在線二甲基化標記與二維液相色譜-基質輔助激光解吸-飛行時間質譜(2DLC-MALDI-TOF/TOF MS)的聯(lián)用。此外，Wang 等［20］在固相標記后利用RPLC-SCX-RPLCESI-MS/MS 平臺分析了人肝癌樣品與正常組織樣品，發(fā)現(xiàn)了94種蛋白質在肝癌樣品中上調，249種蛋白質在肝癌樣品中下調。Boersema 等［21］建立了二甲基化標記的標準流程，并分別建立了固相萃取柱標記、溶液標記和在線反相預柱標記三種方法。Qin 等［22］以磷酸化功能修飾的有序介孔有機硅為吸附劑，實現(xiàn)了內(nèi)源性磷酸化肽段的富集和原位二甲基化標記，并成功用于肝癌病人和正常人血液中內(nèi)源性磷酸肽的相對定量分析。Sun 等［23］在利用酰肼球富集糖肽的同時，進行糖肽的原位二甲基化標記，實現(xiàn)了高準確、高回收率的糖蛋白質組相對定量分析。

利用二甲基化標記試劑的組合可以實現(xiàn)樣品的多重標記，進而實現(xiàn)多種樣品的蛋白質組相對定量。Boersema 等［24］利用CH2O和NaCNBH3、CD2O和NaCNBH3以及13CD2O和NaCNBD33種標記試劑的組合，實現(xiàn)了蛋白質胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的三重標記。Song 等［25］用輕、重試劑標記相同的樣品，中標試劑標記另一份樣品，實現(xiàn)了準三重標記;通過比較輕重標記，一次運行可得到兩個定量結果，實現(xiàn)了高準確度和高精度的蛋白質組相對定量分析。Hsu 等［26］利用CH2O、CD2O、NaCNBH3和NaCNBD34種試劑組合標記Lys-C 酶解的肽段，實現(xiàn)了4種樣品的同時分析;利用CH2O、CD2O、13CD2O、NaCNBH3和NaCNBD3有機組合標記Lys-C 酶解產(chǎn)物，還可以實現(xiàn)五重樣品的同時分析。

1.1.3 基于酶解標記的相對定量方法

18O 標記是目前酶解標記的唯一方法［10］。采用該方法僅需要在酶解過程中使用H218O。使用的蛋白酶可以為胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、Glu 蛋白酶(Glu-C)和多肽內(nèi)切酶(Lys-C)等絲氨酸蛋白酶類;在這些酶的催化下，可以在肽段C 端增加2個18O 原子。18O 標記既可用于非修飾蛋白質組的相對定量，而且也可以將肽段末端的18O 標記與去糖鏈過程的18O 標記相結合，實現(xiàn)糖肽位點和糖鏈的相對定量分析［27，28］。此外，將iTRAQ和18O 標記結合，還可以在實現(xiàn)糖蛋白質樣品多重定量的同時，實現(xiàn)糖肽位點的確認［29］。將18O與二甲基化標記相結合，還可基于等重標記實現(xiàn)蛋白質組的高精度和高準確度的相對定量分析［30］。

近期基于固定化酶反應器的酶解也逐漸被用于酶解標記。該方法不僅能減少標記過程中回交的發(fā)生，還能顯著提高標記效率，縮短標記時間［31，32］。

1.2 基于串級質譜的相對定量方法

盡管基于一級質譜的蛋白質組定量方法種類多，應用廣泛，但是仍存在以下問題:1)定量的準確度受噪音離子的干擾，造成低峰強度組分的定量結果不準;2)定量動態(tài)范圍低;3)難以實現(xiàn)同時超過四重標記。為解決上述問題，近年來基于串級質譜的蛋白質組相對定量方法受到了越來越多的關注。

基于串級質譜的蛋白質組相對定量方法可以分為基于報告離子和碎片離子的兩種定量方法。前者主要是使用等重標記試劑，如iTRAQ和串聯(lián)質量標簽(TMT)［33］等，通過二級譜或三級譜的報告離子強度實現(xiàn)定量;后者則利用不同標記肽段的成對的碎片離子的強度實現(xiàn)定量。

1.2.1 基于報告離子的相對定量方法

iTRAQ［6］和TMT［33］是最常用的基于報告離子的蛋白質組相對定量方法。其中利用iTRAQ 試劑可以實現(xiàn)八重標記，利用TMT 試劑可以實現(xiàn)六重標記。通過方法改進或者與其他方法結合，可實現(xiàn)更多重的標記，進而提高蛋白質組相對定量的通量，是該類方法的研究目標之一。Dephoure 等［34］將三重SILAC 標記結合六重TMT 標記，實現(xiàn)了18種樣品的同時分析。Werner 等［35］和McAlister 等［36］利用高分辨質譜將TMT 試劑由六重增加為八重，顯著提高了該方法的分析通量。近期也發(fā)展了一些新的基于報告離子的相對定量方法，包括N，N-二甲基化亮氨酸定量標簽(N，N-dimethyl leucines，DiLeu)［37］、氘代等重氨基反應標簽(deuterium isobaric amine-reactive tags，DiART)［38］、加州理工等重標記(Caltech isobaric tags，CIT)［39］、可裂解等重親和標簽(cleavable isobaric labeled affinity tag，CILAT)［40，41］。其中CIT 可以根據(jù)需要設計試劑，實現(xiàn)n 重標記;CILAT單次實驗可以實現(xiàn)十二重標記。

然而，等重標記方法的不足在于，共洗脫組分和目標組分在碎裂池內(nèi)共碎裂，會影響定量的準確度，存在所謂的低估效應(underestimation)，即在復雜生物樣品分析中，共碎裂的離子產(chǎn)生的報告離子會干擾目標母離子在二級譜中報告離子的強度，使得實驗中得到蛋白質的定量結果低于真實值。為了解決該問題，Gygi 等［42］將二級譜中高強度的碎片離子進一步碎裂，利用三級譜中的報告離子強度進行定量。除此以外，Gygi 等［43］利用TMT 標記在二級譜中會產(chǎn)生與TMT 報告離子互補的離子——TMT 互補離子(TMTC)，由于TMTC特異性強，通過去卷積處理也可以實現(xiàn)肽段的準確定量。

1.2.2 基于碎片離子的相對定量方法

基于碎片離子的相對定量方法也可以解決基于報告離子的相對定量方法存在的低估效應。該方法將肽段的N 端和C 端分別用輕標和重標試劑標記，使肽段在一級質譜上具有相同或相似的m/z 而無法分辨，在二級譜碎裂時會形成成對的碎片離子，利用這些碎片離子強度之比可以實現(xiàn)蛋白質的相對定量分析。等重肽末端標記方法(IPTL)［7，44，45］是該類方法的第1個實例，并已經(jīng)實現(xiàn)了3次技術更新，分別利用SA(succinic anhydride)及其同位素形式標記肽段的N 端氨基、MDHI(2-methoxy-4，5-dihydro-1Himidazole)及其同位素形式標記肽段的C 端賴氨酸上的氨基、利用2種肽段鑒定時得分值的不同實現(xiàn)肽段和蛋白質的相對定量［7］。為了提高標記效率和速度，該課題組［45］又開發(fā)了第二代IPTL。使用SA 標記肽段的N 端氨基，同時使用甲醛標記肽段的C 端賴氨酸上的氨基，并開發(fā)了基于強制搜索的IsobariQ 定量軟件。最近，為進一步提高相對定量的通量和選擇性，該課題組［44］利用二甲基化標記方法在酸性條件標記肽段的N 端，堿性條件下標記肽段的C 端賴氨酸上的氨基，并利用甲醛標記試劑種類多的特點實現(xiàn)了三重標記(見圖3)。這也是該類方法唯一實現(xiàn)多重標記的實例。

等重末端標記定量方法(QITL)［30］利用甲醛標記肽段的N 端氨基，18O 標記肽段的C 端(當C 末端為K 時需要胍基化)，從而實現(xiàn)等重標記。該方法定量覆蓋率接近85%，為現(xiàn)有該類方法中定量覆蓋率最高的方法。

除化學標記外，代謝水平標記也可以實現(xiàn)肽段的等重標記。體內(nèi)終端氨基酸代謝標記(IVTAL)［46］是在代謝水平實現(xiàn)等重標記的實例之一。該方法在細胞培養(yǎng)時用(K6，R0)和(K0，R6)分別培養(yǎng)不同的細胞;混合后用Lys-N和Arg-C 兩種酶對蛋白質進行酶切，其中一部分肽段會產(chǎn)生N端為K、C 端為R的序列。這些肽段在一級質譜上沒有差異，而碎裂時會產(chǎn)生明顯的碎片離子對，進而實現(xiàn)蛋白質組的相對定量。索引離子觸發(fā)二級譜離子定量方法(iMSTIQ)［47］是利用代謝標記和化學標記相結合的方法實現(xiàn)等重標記。

基于碎片離子的蛋白質組相對定量方法的優(yōu)點在于，可以克服使用離子阱類質譜的1/3效應，通過使用特征性的碎片離子，提高定量的準確度和精密度。然而該方法同樣存在標記步驟繁多、標記選擇性和反應效率有待提高，以及二級質譜復雜度成倍增加會降低肽段得分、進而減少可定性和定量的蛋白質數(shù)目等問題。

2 基于穩(wěn)定同位素標記的絕對定量方法

圖3 Triplex-IPTL 流程圖［44］Fig.3 Triplex-IPTL approach［44］

基于上述方法，實現(xiàn)上萬蛋白質的相對定量分析已成為現(xiàn)實。然而，對于臨床診斷等，僅僅知道有哪些蛋白質是差異蛋白質尚無法滿足要求，仍需要知道目標蛋白質的絕對定量信息。

基于抗體的絕對定量方法(如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA))具有很高的選擇性和靈敏度，但是受限于抗體種類，且分析通量有待提高?；谫|譜的絕對定量方法能夠實現(xiàn)多種目標蛋白質的定量，因此受到了廣泛的關注。其中，基于穩(wěn)定同位素標記的絕對定量方法是向待測樣品中加入已知量的同位素標記的內(nèi)標肽段、蛋白質或由多種目標肽段構建的串聯(lián)體，并以此衡量樣品中目標蛋白質的量。

基于穩(wěn)定同位素標記肽段為內(nèi)標的絕對定量方法包括絕對定量法(AQUA)［48］、18O 標記［31］、二甲基化標記肽段［49］或者mTRAQ 標記肽段［9］;同位素標記蛋白質為內(nèi)標的絕對定量方法包括全序列重標記蛋白質標準物絕對定量法(PSAQ)［50］、絕對SILAC 方法(absolute SILAC)［51］和全序列表達穩(wěn)定同位素標記蛋白(FlexiQuant)［52］等;同位素標記的串聯(lián)體為內(nèi)標的絕對定量方法包括定量串聯(lián)體(Qcon-CAT)［53］、等電串聯(lián)體(iQCAT)［54］等;基于目標蛋白質片段的絕對定量方法包括蛋白抗原決定基標簽(PrEST)［55］等。上述方法的實驗流程［56］如圖4所示。由于內(nèi)標與樣品混合的步驟越靠前，絕對定量的準確度越高，因此理想的內(nèi)標應該是同位素標記的蛋白質;該蛋白質應具有與目標蛋白質相同的三級和四級結構、相同的翻譯后修飾和已知的蛋白質濃度［57］。

2.1 以同位素標記肽段為內(nèi)標物的絕對定量方法

AQUA 方法［48］是將待測樣品酶解后加入已知量的人工合成的含有穩(wěn)定同位素標記的肽段內(nèi)標物或者用化學法標記上同位素的肽段內(nèi)標物，通過比較目標肽段和添加內(nèi)標物的信號強度，得到目標肽段的含量。由于該方法內(nèi)標肽容易從商業(yè)公司獲取，因而在絕對定量中得到了極為廣泛的應用?；谙嗤脑恚隗w外對目標肽段進行同位素標記，如18O［31］、二甲基化［49］或者mTRAQ［9］標記的肽段，也可以作為內(nèi)標物加入到待測體系，用于實現(xiàn)目標蛋白質的定量。

圖4 基于穩(wěn)定同位素稀釋的蛋白質絕對定量分析流程圖(改編自文獻［56］)Fig.4 Stable isotope dilution strategies for absolute quantification of targeted proteins(adapted from reference［56］)

然而由于該方法是在待測樣品酶解后加入內(nèi)標物，忽視了樣品前處理過程引入的損失，因此定量結果有不確定性。此外，該方法成本較高，難以實現(xiàn)大量目標蛋白質的絕對定量分析。

2.2 以同位素標記蛋白質為內(nèi)標物的絕對定量方法

除了以標記肽段為內(nèi)標外，還可以將目標蛋白質全序列進行同位素標記，如PSAQ［50］，absolute SILAC［51］和FlexiQuant［52］等方法。通過這些方法，可以在細胞外或者細菌體內(nèi)代謝合成全長的同位素標記蛋白質。純化后的蛋白質可以直接加入到細胞提取液中，實現(xiàn)待測樣品中目標蛋白質的絕對定量。盡管采用該方法可以消除所有樣品處理過程引入的定量不確定性，但是僅適用于可溶性蛋白質的定量分析。此外，標記過程較為復雜，難以實現(xiàn)大規(guī)模目標蛋白質的絕對定量。

2.3 以同位素標記串聯(lián)體為內(nèi)標物的絕對定量方法

QconCAT［53］利用了重組DNA 技術，將多種目標蛋白質的目標肽段模擬構建成新的蛋白質，并將對應的質粒轉入到細菌中，在含有同位素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，從而引入同位素標記蛋白質。這些蛋白質經(jīng)純化后，在酶解前加入到待測樣品的蛋白質提取液中。該方法不僅可以同時實現(xiàn)多種蛋白質的絕對定量，而且可以消除酶解過程引入的誤差。盡管在理論上可以有效地產(chǎn)生目標肽段，但是該蛋白質與目標蛋白質的結構不同，酶解效率也可能存在差別。此外，由于該方法無法用于蛋白質樣品酶解前的分級過程，通常一種蛋白質只能用一條肽段去定量，缺乏統(tǒng)計意義。

2.4 基于目標蛋白質片段的絕對定量方法

Mann 等［55］結合人PrEST與SILAC 方法，實現(xiàn)了目標蛋白質的絕對定量。首先將PrEST 在E.coli體內(nèi)表達、純化并定量后，加入到SILAC 標記的樣品中，并通過比較兩者的強度實現(xiàn)目標的定量。該方法不僅可以實現(xiàn)多種蛋白質的同時定量，而且由于內(nèi)標物可以在樣品預處理過程中加入，提高了定量的準確度。

3 結論與展望

現(xiàn)有的蛋白質組定量方法種類繁多，使用范圍廣泛，加速了生命科學的研究進程。然而采用這些方法時，大部分實驗過程都是離線操作。如何減少人為操作，實現(xiàn)樣品定量分析的在線化、集成化，進而提高定量的通量、準確度和精密度是該領域的發(fā)展方向之一。盡管已有許多商品化標記試劑，但是仍需要不斷發(fā)展新型標記試劑，并使其具有標記方法簡單、高效、無副反應、標記后處理簡單、定量結果準確、精密度高、動態(tài)范圍寬、適用的樣品類型范圍廣等優(yōu)點。此外，提高LC-MS，尤其是nanoLC-ESI MS的重現(xiàn)性，對于提高定量結果的精密度至關重要。質譜儀掃描速度、質量精度和分辨率的不斷提高，也必將為蛋白質組定量新方法的發(fā)展提供新的機遇。

目前穩(wěn)定同位素標記的蛋白質組定量方法尚存在一些挑戰(zhàn)，包括如何實現(xiàn)低豐度蛋白質和蛋白質異構體的定量分析、未知基因庫的生物蛋白質表達譜和翻譯后修飾的動態(tài)變化分析等。這些問題的解決，都亟須蛋白質組定量新試劑、新技術和新方法的不斷發(fā)展。

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