王中華，陳 濤

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

白子菜（Crynura divaricata（L.）DC.）為菊科土三七屬植物，其根、莖、葉均可入藥。其根性味甘、涼,能清熱涼血,散淤消腫。其莖、葉性味咸微辛、寒,有毒,具有清熱,舒筋,止血,祛痰之功效。白子菜地上部分可作為藥食兩用之品，廣泛用于治療高血壓病、高脂血癥及糖尿病等，故有“神仙草”之稱。白子菜地上部分含有豐富的黃酮類(lèi)成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明，黃酮類(lèi)化合物有較好的降血糖作用。對(duì)于白子菜的研究目前還處于基礎(chǔ)階段。迄今為止，關(guān)于白子菜中黃酮類(lèi)化合物的研究，國(guó)內(nèi)外的報(bào)導(dǎo)較少，還沒(méi)有利用高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和含量測(cè)定的相關(guān)研究。本文參照高效液相色譜法實(shí)驗(yàn)[1]，采用高效液相色譜法對(duì)白子菜葉中黃酮類(lèi)化合物的（以蘆丁計(jì)）含量進(jìn)行分析測(cè)定，對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化選擇，分析結(jié)果表明此法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確靈敏。本研究為分析白子菜中黃酮類(lèi)化合物的藥用價(jià)值提供相關(guān)的理論依據(jù).可為白子菜的開(kāi)發(fā)利用提供相應(yīng)的參考,具有一定的實(shí)用意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 Waters 600 E高效液相色譜儀；Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器；Waters Empower數(shù)據(jù)工作站；FA1104電子分析天平（上海精科天平廠）；DK98-1型電熱恒溫水浴鍋（雙列六孔、天津中環(huán)科技開(kāi)發(fā)公司）；ACO-3120型真空泵（上海會(huì)行農(nóng)機(jī)廠）；超聲處理器（北京醫(yī)療設(shè)備二廠）；藥典篩（浙江五星沖壓篩具廠）；101-2BS電熱恒溫干燥箱（天津中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司）；ZDHW調(diào)溫型電熱套（5000 mL河北省黃驊中性儀器有限公司）；DL-1單聯(lián)電爐（2000 W北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；玻璃儀器等。

1.2 試藥與試劑 樣品：白子菜（采集于天津中醫(yī)藥大學(xué)植物藥種植基地，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)研究室李天祥教授鑒定為菊科植物白子菜。對(duì)照品：蘆?。ㄙ?gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào)：100080-200707）。甲醇、乙腈，磷酸等為色譜純，其余試劑均為分析純；水為蒸餾水。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)的考察

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的測(cè)定 參照《中國(guó)藥典》2010年版一部“槐花”項(xiàng)下蘆丁的檢測(cè)波長(zhǎng)，用Waters 600 E高效液相色譜儀，流動(dòng)相為甲醇-1%冰醋酸（40∶60），在波長(zhǎng)200～600 nm進(jìn)行掃描，蘆丁對(duì)照品在360 nm處有最大吸收峰，最終確定360 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 流動(dòng)相的考察 參考相關(guān)文獻(xiàn)[2]，篩選出四組流動(dòng)相即：甲醇-0.4%磷酸（50:50）；甲醇-2%磷酸（45∶55）；乙腈-0.4%磷酸（20∶80）；甲醇-1%冰醋酸（40∶60）；在相同的檢測(cè)波長(zhǎng)、流速、進(jìn)樣量的情況下，由于前三組出峰時(shí)間偏短，基線分離不好，所以最終確定流動(dòng)相為：“甲醇-1%冰醋酸（40∶60）”，色譜柱:Xterra@RP185um，柱溫30℃，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.1.3 提取方法的考察 先將白子菜樣品進(jìn)行前處理,以石油醚（30～60℃）回流提取3 h后干燥備用。然后篩選出三種提取方法即：取樣量1.000 g，60%乙醇40 mL超生提取15min；取樣量2.000 g，加甲醇20 mL超生提取15min；取樣量3.000 g，60%乙醇30 mL與25%硫酸3mL，回流提取3 h后乙酸乙酯萃取[2]。在相同的色譜條件下：進(jìn)樣量20 μL”進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，取樣量1.000 g，60%乙醇40mL，超生提取15 min的條件出峰時(shí)間、峰面積、峰型、基線分離度均較好，所以確定其為最佳提取方法。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品1.00 mg，用甲醇定容至10 mL的容量瓶中，即為蘆丁對(duì)照品溶液（濃度0.10 mg/mL）

2.2.2 供試品的前處理 取白子菜的地上部分成熟的葉片，去塵土洗凈晾干，置于烘干箱內(nèi)以60℃干燥2.5 h使葉片水分基本蒸發(fā)，葉片呈土黃色質(zhì)脆易碎，藥用粉碎機(jī)粉碎至能過(guò)1 mm孔徑篩的粗粉，置于干燥的容器中備用。

精密稱取白子菜粗粉3.006 g和3.007 g，分別加石油醚（30～60℃）150 mL，置于索式提取器中回流提取 3 h（料液比 1∶50，水浴溫度 55 ℃），濾過(guò)，棄去石油醚提取液，藥粉殘?jiān)谜舭l(fā)皿中水浴60℃、20 min揮干石油醚，后置于干燥容器中備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取經(jīng)前處理的白子菜粗粉1.000 g和1.001 g，各加60%乙醇40 mL（料液比1∶40），置于100 mL三角瓶中稱質(zhì)量，靜置30 min，置超聲提取器中（頻率 50 Hz，功率500 W，溫度56℃）提取15 min，取出冷卻至常溫再稱質(zhì)量，用60%的乙醇補(bǔ)重，過(guò)濾，濾液備用[3]。殘?jiān)侔匆陨戏椒ㄌ崛∫淮?。合并兩次濾液，用60%乙醇分別定容至100 mL的容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，此即為白子菜的供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系的考察 精密稱取干燥的蘆丁對(duì)照品20.0 mg，加甲醇100 mL配制成0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。精密吸取對(duì)照品溶液 1、2、3、3.5、5、6 mL 分別置于25 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，搖勻。精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄蘆丁峰面積。以對(duì)照品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸的計(jì)算，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1），表明在0.0112～0.0672 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，測(cè)定蘆丁峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.837%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取經(jīng)“2.2.2”前處理后白子菜供試品，按“2.2.3”供試品溶液制備操作，按“2.1”方法學(xué)考察中確定的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，測(cè)得其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.76%，符合要求。

2.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取經(jīng)“2.2.2”前處理后白子菜供試品，按“2.2.3”供試品溶液制備操作，配制平行樣6份，按“2.1”方法學(xué)考察中確定的色譜條件，每次20 μL，計(jì)算蘆丁平均含量為 0.729（mg/g），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.49%，符合要求。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取經(jīng)“2.2.2”前處理后白子菜供試品，按“2.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，以“2.1”方法學(xué)考察中確定的色譜條件，分別在 0、2、4、6、8、10、12 h測(cè)定，結(jié)果蘆丁峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.76%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取經(jīng)“2.2.2”前處理后的白子菜供試品6份，每份1 g，分別置100 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入3 mL蘆丁對(duì)照品溶液（濃度 0.10 mg/mL），同“2.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液。依法測(cè)定結(jié)果，結(jié)果顯示供試品的平均回收率為98.7%，見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.1 Experimental results of average recovery（n＝6）

2.9 樣品的含量測(cè)定 分別精密吸取供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，在流動(dòng)相為甲醇—1%冰醋酸（40∶60），柱溫 30 ℃，流速 1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，每隔2 h進(jìn)樣1次，共進(jìn)樣6次，取平均值按回歸方程計(jì)算蘆丁的含量，結(jié)果樣品中蘆丁的平均含量為 0.729（mg/g），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.49%（n=6）。（見(jiàn)表 2、圖 2、圖 3）。

表2 樣品的含量測(cè)定（n＝6）Tab.2 Assaying of samples（n＝6）

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，依據(jù)本實(shí)驗(yàn)考察確定的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)白子菜中蘆丁的含量采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果蘆丁的峰形對(duì)稱，與相鄰雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，蘆丁濃度與峰面積極顯著相關(guān)，回歸方程為：y贊=11.298x+0.0521，r=0.9991，結(jié)果顯示白子菜中蘆丁的平均含量為0.729（mg/g）。本方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度和精密度較高，可用于含蘆丁天然植物及其制劑的質(zhì)量控制和檢測(cè)。

白子菜抗逆性強(qiáng)，已實(shí)現(xiàn)人工栽培，栽培容易，生長(zhǎng)周期短，產(chǎn)量高，實(shí)際生產(chǎn)中每667 m2，年可收獲葉和嫩莖5000～8000 kg。對(duì)其深入開(kāi)發(fā)和研究可提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、使用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，有利于資源的開(kāi)發(fā)利用，可作為綠色天然功能食品，改善人們的膳食結(jié)構(gòu)，提高人們的健康水平。

鑒于白子菜資源豐富，深入研究白子菜提取物的藥用和臨床價(jià)值，尤其是對(duì)糖尿病患者的降糖作用機(jī)制，以及其對(duì)小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶活性的影響[4]。為其開(kāi)展對(duì)糖尿病的預(yù)防和治療，建立相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

未來(lái)還應(yīng)進(jìn)一步建立白子菜黃酮類(lèi)化合物中的槲皮素[5]、以及多糖類(lèi)成分的含量測(cè)定方法和標(biāo)準(zhǔn)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 王津江.白背三七總黃酮的提取工藝研究[J].中國(guó)藥師，2009，12（2）：146-149.

[3] 李 輝.超聲輔助提取白背三七總黃酮[J].食品科學(xué)，2011，32（14）：144-146.

[4] 馬正東.白背三七水提取物對(duì)2型糖尿病大鼠的降血糖作用及其機(jī)制[J].中草藥，2010，41（4）：623-626.

[5] 冼寒梅.白子菜藥材薄層色譜鑒別的實(shí)驗(yàn)研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2008，35（2）：259-260.