季興躍，吳林韜，李思陽，易紅，金潔，李卓榮

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基于吩噻嗪類化合物的新型抗結(jié)核小分子化合物的設(shè)計、合成及活性研究

季興躍，吳林韜，李思陽，易紅，金潔，李卓榮

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所有機化學室

借助計算機虛擬篩選技術(shù)設(shè)計并合成新型抗結(jié)核小分子化合物。

以氯丙嗪為模板分子，利用 Discovery studio 3.0 構(gòu)建相應的 3D 藥效團模型，并對虛擬化合物庫進行篩選；對篩選結(jié)果進行手動擇優(yōu)選擇，化學合成目標化合物并進行體外抗結(jié)核分枝桿菌的活性評價。

篩選得到活性化合物 15 個，并合成其中 13 個，其中化合物 9（多巴胺）在體外對結(jié)核分枝桿菌表現(xiàn)出中等強度的抑制作用，MIC 為 8.0 μg/ml。

通過藥效團的方法篩選得到了結(jié)構(gòu)較吩噻嗪類化合物簡單的抗結(jié)核活性小分子多巴胺，該化合物作為抗結(jié)核分枝桿菌的先導化合物，較吩噻嗪類具有更大的結(jié)構(gòu)修飾空間。

抗結(jié)核藥； 計算機輔助設(shè)計； 多巴胺； 吩噻嗪

由結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病至今仍然是一個全球性的健康問題。據(jù)估計，全球有近 1/3 的人口感染結(jié)核分枝桿菌，并且每年大約有 800 萬新增感染人群，約 200 萬人死于結(jié)核病[1-2]。雖然目前的治療方案幾乎能治愈所有藥敏性結(jié)核病，但仍存在很大缺陷，如治療周期長（6 ~ 9 個月）以及嚴重的藥物毒副作用。較長的治療周期嚴重降低了患者的依從性，從而可能導致結(jié)核桿菌耐藥，甚至是多藥耐藥（MDR）。而一旦出現(xiàn)耐藥，一線藥物，如異煙肼、利福平、乙醇丁胺和吡嗪酰胺[3]，就不再有效，只能求助于二線藥物，如氟喹諾酮、卷曲霉素、卡拉霉素等。但是這些二線藥物不僅療效差，而且都存在嚴重的毒副作用[4]。近年來，隨著廣泛耐藥（XDR）結(jié)核病菌的出現(xiàn)[5-6]，以及結(jié)核病與艾滋病的雙重感染使得研發(fā)具有全新結(jié)構(gòu)類型的抗結(jié)核藥物愈來愈迫切。

吩噻嗪類化合物（圖 1）是一類用于治療精神病的藥物，文獻報道其在體內(nèi)外均具有明顯的抑制結(jié)核病菌的活性，最小抑菌濃度（MIC）在 0.9 ~ 32 μg/ml[7]。并且，該類化合物對多藥耐藥以及廣泛耐藥的結(jié)核病菌也表現(xiàn)出一定的抑制活性，且能增強一些一線藥物的治療效果[7]。然而，由于該類化合物抗結(jié)核病菌的活性不夠強，而且長期服用會導致毒副作用，使得該類化合物在臨床上用于治療結(jié)核病受到嚴重的限制。為了克服這些缺點，很有必要對其進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化以提高其抗結(jié)核活性及降低毒副作用。但是，這類化合物普遍具有較高的親脂性，即便是通過優(yōu)化得到體外活性較好的化合物，很可能因為其水溶性差以及其他一些不理想的藥代動力學屬性而很難繼續(xù)研究開發(fā)。所以，較好的選擇是以該類化合物的三維結(jié)構(gòu)作為參考，設(shè)計篩選出結(jié)構(gòu)簡單的苗頭（hits）或者先導（lead）化合物，再進行進一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。

本論文即是基于吩噻嗪類化合物的抗結(jié)核活性及其結(jié)構(gòu)特征，應用虛擬篩選技術(shù)（virtual screening）來尋找結(jié)構(gòu)簡單的具有抗結(jié)核活性的新型先導結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分子模擬軟件 藥效團的構(gòu)建以及化合物庫的虛擬篩選均通過美國Accelrys 公司的 Discovery studio 3.0（DS 3.0）軟件中的相關(guān)模塊來完成。

1.1.2 試劑及儀器 所有試劑（包括目標化合物9 和 10）均為市售化學純或分析純，購于北京百靈威公司；MP90 型自動熔點儀為瑞士 Mettler Toledo 公司產(chǎn)品，溫度未校正；MERCURY-400 型核磁共振儀為美國 Varian 公司產(chǎn)品，內(nèi)標為 TMS；AutoSpec Ultima-Tof 串聯(lián)質(zhì)譜儀為英國 Micromass 公司產(chǎn)品。

圖 1 吩噻嗪類化合物的化學結(jié)構(gòu)

Figure 1 The structure of several known phenothiazines

1.2 方法

1.2.1 藥效團的構(gòu)建及虛擬篩選策略 由于吩噻嗪類化合物抗結(jié)核作用的靶蛋白未知，所以不能應用對接（docking）的方法來虛擬篩選。因此，選用基于配體（藥效團）的技術(shù)來進行虛擬篩選。由于與吩噻嗪類化合物具有一致的抗結(jié)核作用機制，并且結(jié)構(gòu)類型完全不同的化合物不可得，所以在構(gòu)建 3D 藥效團的時候，我們選用氯丙嗪（cholorpromazine）作為模板分子，并假設(shè)其最低能量構(gòu)象為活性構(gòu)象，應用 DS 3.0 軟件包中的“Auto pharmacophore generation”模塊來自動生成藥效團。具體方法如下：氯丙嗪的化學結(jié)構(gòu)由ChemDraw 構(gòu)建并另存為mol 格式，導入DS 3.0 中，利用“Full minimization”模塊對其進行能量最小化，Max steps 設(shè)為1000，其他參數(shù)設(shè)定為缺省值，得到最低能量構(gòu)象。再利用“Auto pharmacophore generation”產(chǎn)生3D 藥效團。并對其進行適當?shù)男薷囊杂糜诨衔飵斓奶摂M篩選。我們用該藥效團作為提問式（query）對本室虛擬化合物庫進行篩選。先應用DS 3.0 中的“Ligand pharmacophore mapping”進行虛擬篩選，“Conformation generation”設(shè)定為“fast”，“Maximum omitted features”設(shè)定為“1”，其他參數(shù)設(shè)定為缺省值。根據(jù)Linpinski 和 Veber 原則去掉篩選結(jié)果中成藥性差的化合物。同時，為了降低吩噻嗪類化合物神經(jīng)系統(tǒng)方面的副作用，對得到的化合物進行了藥代動力學屬性的評價（ADMET），過濾掉易透過血-腦脊液屏障和具有潛在肝毒性的化合物，最終我們得到大約 300 個化合物。隨后我們根據(jù)匹配值（Fitvalue）、化合物的多樣性以及可合成性對這 300 個化合物進行手動的擇優(yōu)挑選。

1.2.2 目標化合物的合成 通過虛擬篩選得到目標化合物 15 個，其中化合物 9 和 10 通過購買得到，其他 13 個化合物均為本實驗室合成，合成路線如圖 2 ~ 5。

化合物 1a ~ 1c 經(jīng)過相應的酰氯與各種脂肪胺在二氯甲烷中，以三乙胺為縛酸劑縮合得到，其中化合物 1b由相應的 N-叔丁氧基羰基衍生物 1b' 經(jīng)三氟乙酸脫保護得到（圖 2）。

A：CH2Cl2、Et3N 和各種取代胺，0 ℃~ 室溫，收率70% ~ 80%；B：CH2Cl2、CF3COOH，室溫，收率 85%

Figure 2 Synthesis of compounds 1a - 1c

化合物 2a ~ 2f 由相應的取代芳胺與氯乙酰氯縮合反應得到，其在堿性條件下，與嗎啉發(fā)生親核取代反應得到目標產(chǎn)物 3a ~ 3f（圖 3）。

化合物 4' 與二氯亞砜加熱回流，并以 N,N-二甲基甲酰胺為催化劑得到中間體化合物 4，化合物 4 再與各種脂肪胺發(fā)生親核取代反應得到目標產(chǎn)物 5a ~ 5b（圖 4）。

A：CH2Cl2、Et3N 和氯乙酰氯，0 ℃~室溫，收率 70% ~80%；B：無水 K2CO3、DMF，60 ℃，收率 70% ~80%

Figure 3 Synthesis of compounds 3a - 3f

A：SOCl2和 DMF，回流，2 h，收率 90%；B：K2CO3和 DMF，60 ℃，3 h，收率 70% ~ 80%

Figure 4 Synthesis of compounds 5a and 5b

鄰氨基苯甲酸甲酯與苯甲酰氯縮合得到化合物 6。為了實現(xiàn)化合物 6 酯基的選擇性水解，采用氫氧化鈉為堿，四氫呋喃和水做混合溶劑，在室溫反應得到了選擇性水解產(chǎn)物化合物 7。以 DIC為縮合劑，化合物 7 再與脂肪胺縮合得到目標產(chǎn)物 8a 和 8b（圖 5）。

A：苯甲酰氯、CH2Cl2、Et3N，0 ℃~室溫，收率 80%；B：NaOH、THF/H2O，室溫，收率 85%；C：DIC、CH2Cl2，室溫，收率 75%

Figure 5 Synthesis of compounds 8a and 8b

1.2.3 抗結(jié)核分支桿菌活性實驗 Alamar blue 法檢測化合物抑制結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv 復制活性。異煙肼和利福平作為陽性對照。受測化合物儲存液濃度為64 μg/ml，最終稀釋濃度為 0.5 ~ 32.0 μg/ml。用 7H9 培養(yǎng)基進行 2 倍稀釋后接種于 96 孔板中，每孔 100 μl。每孔加入 100 μl 菌懸液，使其最終滴度為 1 × 106CFU/ml。將 96 孔板置于 37 ℃條件下培養(yǎng) 5 d，每孔加入 Alamar blue 溶液后，酶標儀測定各孔熒光值。MIC 定義為使熒光值用溶劑對照組校正后相對生長下降≥ 90% 的最低藥物濃度。

2 結(jié)果

2.1 藥效團的構(gòu)建

以氯丙嗪為模板分子，通過 DS 3.0 中的“Auto pharmacophore generation”模塊產(chǎn)生 3D 藥效團，得到了如圖 6a 所示的 3D 藥效團模型，其包含2 個疏水中心（藍色）、一個氫鍵受體（綠色）、一個芳香環(huán)中心（橙色）以及一個正電荷中心（紅色）。

考慮到在吩噻嗪環(huán)的 2 位上沒有取代基的其他化合物也具有體外抗結(jié)核分枝桿菌的活性，如甲地嗪和甲硫噠嗪（圖 1），因此我們將藥效團6a中與氯原子相對應的疏水中心刪掉，得到6b 所示的藥效團，并以此作為提問式（query）對化合物庫進行虛擬篩選。

2.2 目標化合物的合成

對 13 個目標化合物進行了合成制備，結(jié)構(gòu)均經(jīng)過1H-NMR 譜和高分辨質(zhì)譜的確證。所有目標化合物的編號及化學名如表 1 所示。

6a：以氯丙嗪為模板分子在 DS 3.0中構(gòu)建得到的 3D 藥效團；6b：刪除 6a 中一個疏水中心特征得到的 3D 藥效團

Figure 6 The 3D pharmacophore model

2.3 體外抗結(jié)核分枝桿菌活性

Alamar blue 法檢測化合物抑制結(jié)核分枝桿菌標準株 H37Rv 復制活性。其最小抑菌濃度（MIC）結(jié)果如表 2 所示。

表 1 目標化合物編號及化學名

Table 1 The serial number and chemical name of the target compounds

化合物編號Compound No.化學名Chemical name 1aN-(2-嗎啉乙基)-3-苯基-5-甲基異噁唑-4-甲酸胺 1b3-(3'-苯基-5'-甲基異噁唑-4'-甲酰胺基)丙胺 1cN-[3-(二甲胺基)丙基]-3-苯基-5-甲基異噁唑-4-甲酰胺 3a2-(2'-嗎啉乙酰胺基)-4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩-3-甲酸甲酯 3b2-(2'-嗎啉乙酰胺基)苯甲酸甲酯 3c3-(2'-嗎啉乙酰胺基)苯甲酸甲酯 3d2-(2'-嗎啉乙酰胺基)噻唑-4-甲酸乙酯 3e2-(2'-嗎啉乙酰胺基)噻吩-3-甲酸乙酯 3f5-(2'-嗎啉乙酰胺基)異酞酸二甲酯 5a4-[3-(二甲氨基)丙氨基]-5-甲基噻唑酮[2,3,-d]嘧啶-6-甲酸乙酯 5b4-(3-嗎啉丙氨基)-5-甲基噻唑酮[2,3,-d]嘧啶-6-甲酸乙酯 8aN-[3-(二甲胺基)丙基]-2-苯甲酰氨基苯甲酰胺 8bN-(3-嗎啉丙基)-2-苯甲酰氨基苯甲酰胺

由表 2 可看出，雖然所有化合物與藥效團匹配的 Fitvalue 值都較高，但是大部分評價的化合物在體外對所測菌株并未表現(xiàn)出明顯的抑制活性，僅化合物 9 表現(xiàn)出了中等的抑菌活性（MIC =8.0 μg/ml）。如圖7 所示，其與氯丙嗪能較好的疊合。與化合物 9 結(jié)構(gòu)相似的化合物 10 也未表現(xiàn)出明顯的抑菌活性，對比兩者與藥效團匹配的構(gòu)象可看出（圖 8），兩者在與藥效團特征元素的匹配方面并沒有太大的差異，區(qū)別在于非藥效團部分的取代基不一致：化合物 10 苯環(huán)上少了一個羥基取代；芐位多了一個羥基取代以及氨基多了一個甲基取代。由于化合物 9 中的羥基并不是藥效團特征，所以導致化合物10 活性消失的原因可能是由于芐位的羥基取代或者氮上的甲基取代，但是由于大多吩噻嗪類化合物在側(cè)鏈氮原子上也有烷基取代，因此可推測，化合物 10 活性消失可能和其芐位多了一個羥基取代有關(guān)。關(guān)于該化合物的構(gòu)效關(guān)系有待進一步研究確證。

表 2 目標化合物在體外抑制 MTB H37Rv ATCC 27294 菌株活性

Table 2 The MIC values of target compounds against MTB H37Rv ATCC 27294

化合物 Compounds匹配值 FitvaluesMIC (μg/ml) 1a3.03843> 32.0 1b3.02076> 32.0 1c3.20111> 32.0 3a2.92558> 32.0 3b2.69706> 32.0 3c2.90048> 32.0 3d2.9348> 32.0 3e3.74493> 32.0 3f2.89993> 32.0 5a3.15314> 32.0 5b3.08974> 32.0 8a2.8179> 32.0 8b3.11325>32.0 92.755088.0 102.93592> 32.0 異煙肼 Isoniazid-0.05 利福平 Rifampicin-0.09

Figure 7 The superimposing conformations of cholorpomazine and compound 9 (green)

圖 8 化合物 9 和 10 與藥效團匹配的構(gòu)象

Figure 8 The conformations of compounds 9 and 10 generated by pharmacophore mapping

3 討論

化合物 9（多巴胺）在體外表現(xiàn)出了一定的抗結(jié)核活性。由于多巴胺與吩噻嗪類化合物相比具有較低的分子量和 AlogP 值（分別為 153.178 和 0.773，由 DS3.0 計算得到），且均滿足“似先導物三原則”[8-9]所限定的條件（分子量≤ 300；AlogP ≤ 3；不超過 3 個氫鍵給體及受體）。而對于吩噻嗪類化合物，以氯丙嗪為例，其分子量和 AlogP 值分別為 318.096 和 4.739，均超出了“似先導物三原則”的范圍。由于先導物結(jié)構(gòu)優(yōu)化的過程往往伴隨著分子量和 AlogP 的增加[10]，而具有高分子量和 AlogP 值的化合物往往具有較差的藥代動力學屬性，如口服吸收弱，極易被代謝排出體外等。所以吩噻嗪類化合物結(jié)構(gòu)優(yōu)化的空間相對多巴胺較小，也就是說，多巴胺較之吩噻嗪類化合物“更像先導化合物”。

僅靠藥效團來篩選活性化合物是不夠的。由藥效團得到的結(jié)果往往假陽性率較高[11]，因為藥效團只考慮配體和模型的相互匹配，而沒有考慮靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)。很多化合物雖然能很好地與藥效團匹配，但是其分子結(jié)構(gòu)中非藥效團部分很可能與靶蛋白發(fā)生不合理的碰撞，從而在體外表現(xiàn)為非活性分子。所以在虛擬篩選的過程中，為了降低此類假陽性率，往往在藥效團的基礎(chǔ)上增加一個排除體積，或是將藥效團初篩得到的結(jié)果再進行與靶蛋白的對接，最終以對接結(jié)果來作為挑選苗頭化合物的標準[12]。但是，增加排除體積和對接都有一個前提，就是活性小分子的作用靶點及其三維結(jié)構(gòu)已知。在本論文中，吩噻嗪類化合物抗結(jié)核的作用靶點未知，所以只能用藥效團的方法來進行虛擬篩選。另外，由于在構(gòu)建藥效團時，除了吩噻嗪類化合物外，并沒有其他結(jié)構(gòu)類型的化合物可用來與吩噻嗪類化合物進行疊合，所以單純以氯丙嗪作為模板分子產(chǎn)生的藥效團難以全面地反映該類化合物抗結(jié)核的作用特點。此外，本論文是假設(shè)氯丙嗪的最低能量構(gòu)象為其活性構(gòu)象，而實際情況可能與此構(gòu)象存在一定的偏差，所以由此產(chǎn)生的藥效團特征在空間上的相對位置可能存在偏差。這些都是本論文篩選得到的化合物假陽性較高的原因。

志謝 感謝北京結(jié)核病研究所路宇老師課題組和南京市胸科醫(yī)院對目標化合物體外抗結(jié)核活性的測定。

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Design, synthesis and bioactivity of novelantituberculoticagents based on phenothiazines

JI Xing-yue, WU Lin-tao, LI Si-yang, YI Hong, JIN Jie, LI Zhuo-rong

Department of Medicinal Chemistry, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

To design and synthesize novel antituberculotic agents by employing computer aided drug design.

Cholorpromazine was used as modulate compound to generate 3D pharmacophore hypotheses in Discovery studio 3.0, and our in-house compounds library was screened. The candidate compounds were cherry-picked manually for synthesis and evaluation for their anti-TB activity(MTB H37Rv ATCC 27294).

15 active compounds were obtained from the screening and 13 of them were synthesized. The bioassay results showed that compound 9 (dopamine) presented moderately potent inhibitory activity againstwith MIC value of 8.0 μg/ml.

Dopamine was active againstwith lower molecular weight and LogP value. As a lead antituberculotic compound, it shows potential for optimization to improve anti-TB activity by comparison with the phenothiazines.

Antitubercular agents; Computer-aided design; Dopamine; Phenothiazines

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.005

“十二五重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2012ZX0930 1002-001-017）

李卓榮，Email：l-z-r@263.net

2012-12-07

LI Zhuo-rong, Email: l-z-r@263.net