林淑嫻，楊芳芳，彭毅，李研，方毅敏，黎意芬，賴小敏

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酶聯(lián)免疫斑點法對抗結(jié)核治療期肺結(jié)核患者多肽特異性IFN-γ的檢測

林淑嫻，楊芳芳，彭毅，李研，方毅敏，黎意芬，賴小敏

510080 廣州，中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院微生物教研室，熱帶病防治研究教育部重點實驗室，海洋微生物功能分子廣東省高校重點實驗室，廣東省重大傳染病預(yù)防和控制技術(shù)中心（林淑嫻、楊芳芳、彭毅、李研、賴小敏）；510095 廣州市胸科醫(yī)院內(nèi)科（方毅敏、黎意芬）

運用酶聯(lián)免疫斑點法檢測結(jié)核患者外周血 IFN-γ，探討結(jié)核患者結(jié)核多肽特異性 IFN-γ 分泌水平隨抗結(jié)核治療的變化。

采用結(jié)核混合多肽 E6 + E7 + C14、E6 + E7 作為刺激抗原，對 331 個處于治療前或 1、2、3、4、5 和 6 個月治療期的肺結(jié)核患者外周血標(biāo)本進(jìn)行多肽特異性 IFN-γ 酶聯(lián)免疫斑點法（ELISPOT）檢測。

治療前的肺結(jié)核患者其 ELISPOT 陽性檢測率均高于痰涂片和痰培養(yǎng)陽性率（E6 + E7 + C14-ELISPOT 92.5%、E6 + E7-ELISPOT 89.7%、痰涂片 41.0%、痰培養(yǎng) 59.0%），且差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.010 和< 0.001）。在抗結(jié)核治療各個時期，肺結(jié)核患者 IFN-γ-ELISPOT 檢測陽性率和斑點數(shù)（spot forming cells/106cells, SFP）隨著治療的進(jìn)行持續(xù)下降，由治療前高水平（E6 + E7 + C14-ELISPOT 陽性率 92.5%、SFP 計數(shù)中值 M = 381；E6 + E7-ELISPOT 陽性率 89.7%、SFP 計數(shù)中值 M = 168）降至第 6 個月治療結(jié)束時低水平（E6 + E7 + C14-ELISPOT 43.6%、M = 40；E6 + E7-ELISPOT 38.1%、M = 36）。痰涂陽性患者的 SFP 計數(shù)持續(xù)處在高位，且治療 6 個月痰涂陽性患者的 SFP 計數(shù)顯著高于痰涂陰性患者。

兩種混合多肽 IFN-γ-ELISPOT 可提高結(jié)核患者的診斷率，同時檢測抗結(jié)核治療患者的 IFN-γ 分泌水平以監(jiān)測抗結(jié)核治療的效果。

結(jié)核，肺； 免疫酶技術(shù)； 細(xì)胞； 抗結(jié)核治療

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的呼吸道傳染病，全球大約有三分之一的人口感染過結(jié)核分枝桿菌（，MTB）[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新數(shù)據(jù)，結(jié)核病是引起人類死亡的第二殺手[2]。我國既是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，也是耐多藥結(jié)核病流行嚴(yán)重國家。監(jiān)測抗結(jié)核治療患者的治療效果，根據(jù)效果及時調(diào)整治療方案，有利于防止耐藥菌株的出現(xiàn)。酶聯(lián)免疫斑點試驗是一種基于抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的新型免疫檢測技術(shù)，已被證明在結(jié)核診斷、檢測潛伏感染、監(jiān)測治療效果等方面有潛在的應(yīng)用價值[3-5]。目前，在國外，基于 ELISPOT 原理、商業(yè)化的 T-SPOT.TB已被多個國家批準(zhǔn)使用[6-7]，但由于價格昂貴而限制了在我國的廣泛使用。本研究采用 E6 + E7 + C14、E6 + E7 混合多肽為刺激物，檢測抗結(jié)核治療期結(jié)核患者外周血的 IFN-γ 分泌水平，探討結(jié)核患者的治療效果與結(jié)核多肽刺激下 IFN-γ 分泌水平之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 96 孔 ELISPOT 板購自美國 Millipore 公司；包被抗體（anti-human IFN-γ）、生物素標(biāo)記抗人 IFN-γ 抗體購自美國 eBioscience 公司；堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素，底物 NBT、BCIP 均購自美國 Thermo 公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基購于美國 Gibco 公司；新生小牛血清購于澳大利亞 HyClone 公司；淋巴細(xì)胞分離液購于荷蘭 Amersham Bioscience 公司；ELISPOT 讀板系統(tǒng)購于美國 Cellular Technology 公司。E7（中國授權(quán)發(fā)明專利號：200810220523.1）、E6（中國發(fā)明專利公開號：201110130364.8）、C14 多肽委托西安華辰生物科技有限公司合成，純度為 98%，其中 E6、E7 來源于 MTB 分泌性蛋白 ESAT-6，C14 則來源于另外一種分泌性蛋白 CFP-10。

1.1.2 標(biāo)本來源 共納入結(jié)核患者 331 例，男性 225 人，女性 106 人，年齡中位數(shù)（M）為 41（四分位間距：27 - 52）。全部患者均依據(jù)臨床表現(xiàn)、細(xì)菌學(xué)、影像學(xué)或抗結(jié)核藥物療效明確診斷為肺結(jié)核。肺外結(jié)核及其他肺炎、肺癌患者不納入研究，年齡小于 15 歲的肺結(jié)核患者排除在外。331 例納入研究的患者均于 2010 年 9 月到 2011 年 10 月期間在廣州市胸科醫(yī)院接受抗結(jié)核治療。331 例患者按治療時間進(jìn)行分組，其中治療前有 39 人，治療時間 1、2、3、4、5 和 6 個月分別有 39、55、40、40、63 和 55 人。廣州人口遷移性大，加之追蹤時間較長，納入研究患者并未能在所有研究時間點抽血進(jìn)行IFN-γ ELISPOT 檢測，但是所有患者追蹤監(jiān)測時間都包含在治療前、治療 1、2、3、4、5 和 6 個月這 7 個治療時間點。由于經(jīng)濟(jì)上的原因，331 例納入研究患者中，只有治療前抽血的患者有相應(yīng)的痰培養(yǎng)檢測；在治療前、治療 2 個月和 6 個月抽血的患者有相應(yīng)的痰涂片檢測。

1.2 方法

1.2.1 外周血標(biāo)本 所有研究對象均采用乙二胺四乙酸（EDTA-K2）抗凝靜脈血，采樣后在 6 h 之內(nèi)采用梯度密度離心法分離新鮮的外周血單個核細(xì)胞（PBMC）用于 ELISPOT 檢測。

1.2.2 結(jié)核多肽特異性 IFN-γ-ELISPOT 檢測方法 分離得到的 PBMC細(xì)胞用含 10% 新生小牛血清和 100 U 抗生素的 RPMI 1640 重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度，使加入已包被抗人 IFN-γ 的 ELISPOT 板中的細(xì)胞為每孔2.5 × 105個。陽性對照孔加入豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯（PMA，25 ng/ml）和離子霉素（ionomycin，1 μg/ml）；陰性對照孔不添加任何刺激物；實驗孔加入特異性多肽抗原，濃度為20 μg/ml。將細(xì)胞置 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h 后，用含 0.25% 吐溫 20 的磷酸緩沖液（PBST）洗板 10 次；接著加生物素標(biāo)記抗人 IFN-γ（0.5 μg/ml）室溫孵育2 h；PBST 洗板 5 次，用堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素（2 μg/ml）室溫孵育 2 ~ 2.5 h，最后，加入底物NBT/BCIP 顯色。晾干后，采用 ELISPOT 讀板分析儀自動掃描儀計數(shù)，Quality Control 系統(tǒng)對自動掃描系統(tǒng)得到的斑點數(shù)（spot forming cells，SFP）進(jìn)行質(zhì)量控制，所得斑點數(shù)乘以系數(shù) 4，即為每百萬（106）所檢測 PBMC 中斑點數(shù)（SFP/106PBMC），實驗組的每百萬 PBMC 中斑點數(shù)減去陰性對照的 SFP，為統(tǒng)計記錄數(shù)據(jù)（即抗原多肽特異性IFN-γ 應(yīng)答水平）；最后 SFP ≥ 50 判斷為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計，GraphPad Prism 5 進(jìn)行作圖。對于 ELISPOT 和細(xì)菌學(xué)診斷的比較采用 McNemar2檢驗；對于不用治療時期的陽性率比較采用 Pearson Chi-Square 檢驗；對于不同治療時期的斑點數(shù)比較，采用 Kruskal Wallis 秩和檢驗。< 0.05 表示差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前患者 IFN-γ ELISPOT 與細(xì)菌學(xué)檢測結(jié)果的比較

表 1 顯示，在治療前患者組，兩種混合多肽（E6 + E7 + C14 和 E6 + E7）的 IFN-γ ELISPOT 陽性檢測率分別為 92.5% 和 89.7%，均高于痰涂片和痰培養(yǎng)陽性率（41.0% 和 59.0%），且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.01 和< 0.001）。

2.2 IFN-γ ELISPOT 在治療過程中的檢測陽性率變化

圖 1 顯示兩種混合多肽在各個治療點的陽性率分布。E6 + E7 + C14-IFN-γ ELISPOT在 7 個治療時間點（治療前、治療 1、2、3、4、5 和 6 個月）陽性率分別為 92.5%、79.0%、70.1%、61.0%、52.5%、41.3% 和 43.6%（圖 1A）。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，治療前與治療 1 個月陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（= 0.112），而與治療 2、3、4、5、6 個月間差異則有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.006 ~< 0.001）；治療2 個月與 5、6 個月之間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.007 和< 0.001），但與 3、4 個月之間無統(tǒng)計學(xué)意義（均 > 0.05）；此外，治療 5 個月與 6 個月之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05）。

表 1 治療前患者 IFN-γ ELISPOT 與細(xì)菌學(xué)檢測結(jié)果的比較

A：E6 + E7 + C14-IFN-γ ELISPOT 的陽性率直方圖；B：E6 + E7-IFN-γ ELISPOT 的陽性率直方圖

Figure 1 The positive percentages of IFN-γ ELISPOT assays with E6 + E7 + C14 or E6 + E7 during treatment time points

A：E6 + E7 + C14-IFN-γ ELISPOT 每百萬PBMC 中斑點數(shù)（中線代表中位數(shù)值，SFP/106 PBMC）；B：E6 + E7-IFN-γ ELISPOT 每百萬PBMC 中斑點數(shù)（中線代表中位數(shù)值，SFP/106 PBMC）；**：治療前與治療 1 個月的 SFP 計數(shù)的比較；#：治療 2 個月與治療 5 個月的 SFP 計數(shù)的比較；*：治療 2 個月與治療 6 個月的 SFP 計數(shù)的比較

Figure 2 The quantitative SFP of IFN-γ ELISPOT assays at different time points

E6 + E7-IFN-γ ELISPOT 在 7 個治療時間點的陽性率分別為 89.7%、76.9%、65.4%、57.4%、42.5%、46.0% 和 38.1%（圖 1B）。7 個治療時間點的陽性率之間的差異的統(tǒng)計學(xué)意義表現(xiàn)與 E6 + E7 + C14-IFN-γ ELISPOT 結(jié)果相似，其中治療前與治療 1 個月間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（= 0.192），與治療 2、3、4、5、6 個月間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.01 ~< 0.001）；治療 2 個月與 5、6 個月之間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（均 < 0.05），但與 3、4 個月之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均 > 0.05）；此外，治療 5 個月與 6 個月之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05）。

2.3 IFN-γ ELISPOT 在各個治療期 SFP 計數(shù)

兩種混合多肽 IFN-γ ELISPOT 的 SFP 計數(shù)從治療前的高水平隨著抗結(jié)核治療延續(xù)而持續(xù)降低，至治療 5 ~ 6 個月達(dá)低水平（圖 2）。

E6 + E7 + C14-IFN-γ ELISPOT 的 SFP 計數(shù)（圖 2A）在 7 個時間點的中位數(shù)值分別為 381、339、131、95、58、42 和 40。其中治療前與治療1 個月間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（= 0.463），而與 2、3、4、5、6 個月間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.001 ~< 0.008）；此外，治療 2 個月與 3、4 個月之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均 > 0.05），而與 5、6 個月間差異則有統(tǒng)計學(xué)意義（均 < 0.05）；治療 5 與 6 個月之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05）。

E6 + E7-IFN-γ ELISPOT 的 SFP 計數(shù)（圖 2B）在 7 個時間點的中位數(shù)值分別為 168、160、110、116、41、31 和 36。其中治療前與治療 1、2、3 個月間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均 > 0.05），而與治療 4、5、6 個月間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均 < 0.01）；此外，治療 2 個月與3、4、5 個月間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均 > 0.05），而與 6 個月間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（= 0.009）。

2.4 治療前、治療 2 個月及 6 個月痰涂片陽性與陰性患者 IFN-γ ELISPOT 的 SFP 計數(shù)比較

A1、A2、A3：痰涂陽性和痰涂陰性患者的E6 + E7 + C14-IFN-γ ELISPOT 試驗在治療 0、2、6 個月斑點計數(shù)散點圖；B1、B2、B3：痰涂陽性和痰涂陰性患者的E6 + E7-IFN-γ ELISPOT 試驗在治療 0、2、6 個月斑點計數(shù)散點圖

Figure 3 Comparison of smear positive and smear negative SFP values with IFN-γ ELISPOT assay at months 0, 2 and 6

進(jìn)一步分析治療前、治療 2、6 個月 3 個時間點的 IFN-γ ELISPOT 的 SFP 計數(shù)發(fā)現(xiàn)，痰涂片陽性患者高于陰性患者（圖 3）。在治療前、治療2 個月，痰涂片陽性患者 SFP 計數(shù)（治療前：E6 + E7 + C14，M = 444；E6 + E7，M = 200。治療 2 個月：E6 + E7 + C14，M = 225；E6 + E7，M = 163）比痰涂片陰性患者（治療前：E6 + E7 + C14，M = 300；E6 + E7，M = 162；治療 2 個月：E6 + E7 + C14，M = 128；E6 + E7，M = 108）高，但兩者間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（均 > 0.05；圖 3 A1，A2，B1，B2）；而治療 6 個月，痰涂片陽性患者（E6 + E7 + C14，M = 225；E6 + E7，M = 342）顯著高于痰涂片陰性患者（E6 + E7 + C14，M = 31；E6 + E7，M = 26），且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.001；圖3 A3，B3）。

3 討論

目前結(jié)核病主要以臨床癥狀、胸部 X 光片及細(xì)菌學(xué)檢測作為診斷的主要依據(jù)[8-9]，這些傳統(tǒng)的診斷方法存在診斷率低、誤診率高、耗時長等缺點[10-11]。近年來，發(fā)展起來的 T-SPOT.TB 試劑盒以及類似的 ELISPOT 檢測，在結(jié)核病的診斷運用中不僅快捷、方便，而且其敏感性和特異性達(dá)到 83% ~ 97%[12-15]。本實驗室在前期的工作中，篩選出了 E6、E7 和 C14 三種 MTB 特異性多肽，并以此為基礎(chǔ)建立的 ELISPOT 技術(shù)與 T-SPOT.TB 的敏感性和特異性相似[16]。本研究中，E6 + E7 + C14-ELISPOT（92.5%）和 E6 + E7-ELISPOT（89.7%）對治療前結(jié)核患者的 IFN-γ ELISPOT 陽性檢測率均高于痰涂片（41.0%）和痰培養(yǎng)（59.0%）的陽性率，與文獻(xiàn)報道的 T-SPOT.TB 試劑盒檢測敏感性相似[12, 14, 17-18]。

在本研究中，IFN-γ ELISPOT 在治療過程中的檢測陽性率和 SFP 計數(shù)隨著抗結(jié)核治療的進(jìn)行持續(xù)降低，至 5 ~ 6個月達(dá)低水平，其中治療前和治療 1 個月差異無統(tǒng)計學(xué)意義、而與 2、3、4、5、6 個月間差異有統(tǒng)計學(xué)意義；同時治療 2 個月與治療 5、6 個月，E6 + E7 + C14-IFN-γ ELISPOT 檢測陽性率和 SFP 計數(shù)間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而與 3、4 個月均無統(tǒng)計學(xué)意義；此外，治療前、治療 2 個月，痰涂陽性患者的 IFN-γ ELISPOT 的 SFP 計數(shù)略高于痰涂陰性患者，而到治療 6 個月前者才顯著高于后者。這提示在前期的治療中，肺結(jié)核患者的 IFN-γ 分泌水平處于高位，隨治療病情好轉(zhuǎn)的患者 IFN-γ 分泌水平降低；而痰涂陽性患者的 IFN-γ 分泌水平仍處于高位。

兩種混合多肽 IFN-γ ELISPOT 的 SFP 計數(shù)在各個時間點間統(tǒng)計學(xué)結(jié)果不完全相同，其原因可能是由于納入的病例數(shù)不足或刺激多肽的不同所致。Chee 等[19]應(yīng)用 T-SPOT.TB 追蹤監(jiān)測接受抗結(jié)核治療患者IFN-γ 分泌水平，CFP-10 刺激下 SFP 計數(shù)在各個時間點要比 ESAT-6 高。Adetifa等[20]應(yīng)用 CFP-10 和 ESAT-6 來源 15 個氨基酸長度的多肽作為刺激物，發(fā)現(xiàn) CFP-10 來源多肽刺激下 SFP 計數(shù)在各個時間點要比 ESAT-6 高，這表明同一結(jié)核蛋白來源但長度或氨基酸序列不同的多肽，刺激效果存在差異。本實驗室在前期工作中，篩選出 E6、E7（ESAT-6 來源）、C14（CFP-10 來源）三種 MTB 特異性多肽，組合成 E6 + E7 + C14、E6 + E7 兩種混合多肽檢測分析了確診肺結(jié)核患者 IFN-γ 反應(yīng)水平，結(jié)果為混合多肽的刺激效果要比單個多肽強(qiáng)[16]。而在本研究中，對治療期的肺結(jié)核患者進(jìn)行外周血多肽特異性 IFN-γ 檢測得到相似結(jié)果，E6 + E7 + C14-IFN-γ ELISPOT 在各個時期 SFP 計數(shù)和陽性率均高于 E6 + E7-IFN-γ ELISPOT。

由于人口遷移和追蹤時間長，納入研究患者并未能在所有研究時間點進(jìn)行抽血 IFN-γ ELISPOT 檢測，這是本實驗最大的不足。為彌補這一缺陷，本研究所有納入研究患者追蹤監(jiān)測時間都包含在治療前、治療 1、2、3、4、5 和 6 個月這 7 個治療時間點，按不同治療時間點進(jìn)行分組，同時增加每個治療時間點研究病例數(shù)，以減少個體差異造成的誤差，增加結(jié)果的可靠性，這與 Zhang 等[21]及我們在其他研究方法中使用的分組方式類似。

綜上所述，本實驗室建立起的 ELISPOT 技術(shù)，在前期診斷可以提高痰涂陰性患者結(jié)核的診斷率，后期治療可以輔助監(jiān)測抗結(jié)核治療效果。

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Detection of peptide-specific interferon-gamma with enzyme-linked immunospot assay in patients with pulmonary tuberculosis during the anti-tuberculosis treatment

LIN Shu-xian, YANG Fang-fang, PENG Yi, LI Yan, FANG Yi-min, LI Yi-fen, LAI Xiao-min

Department of Microbiology, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Ministry of Education Key Laboratory of Tropical Disease Control, Guangdong Provincial Department of Education Key Laboratory of Functional Molecules from Marine Microorganisms, Guangdong Provincial Research Center for Severe Infectious Disease Prevention and Control Technology, Guangzhou 510080, China (LIN Shu-xian, YANG Fang-fang, PENG Yi, LI Yan, LAI Xiao-min); Guangzhou Chest Hospital, Guangzhou 510095, China (FANG Yi-min, LI Yi-fen)

To detect IFN-γ in the peripheral blood of pulmonary tuberculosis (PTB) patients by using IFN-γ enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) and investigate peptide-specific IFN-γ levels during anti-TB treatment.

Peptide-specific IFN-gin peripheral blood (PLB) was detected by ELISPOT with(MTB) peptide mixtures E6 + E7 + C14 and E6 + E7 as stimulants. The PLB samples were taken from 331 PTB patients tracked longitudinally before treatment or 1, 2, 3, 4, 5, 6 months after treatment.

Before treatment, the positive detection rates of two kinds of combined peptide mixture IFN-γ-ELISPOT were significantly higher than that of sputum smear and sputum culture (E6 + E7 + C14-ELISPOT 92.5%, E6 + E7-ELISPOT 89.7%; sputum smear 41.0%, sputum culture 59.0%). The positive detection rates and the spot forming cells per 106cells (SFP) of IFN-γ-ELISPOT consistently decreased overall the treatment from higher level before treatment (by E6 + E7 + C14-ELISPOT, positive rate 92.5%, median SFP (M) = 381; by E6 + E7-ELISPOT, positive rate 89.7%, M = 168) to lower level after six months treatment (by E6 + E7 + C14-ELISPOT 43.6%, M=40; by E6 + E7-ELISPOT 38.1%, M = 36). SFP values of patients with positive sputum smear were continued to remain high, and it was higher than that of patients with negative sputum smear aftet 6 months treatment.

The two combined peptide mixture IFN-γ-ELISPOT assays increase the detection rates of PTB patients andmonitor the efficiency of anti-TB treatment by detecting IFN-γ levels in patients with anti-TB treatment.

Tuberculosis, pulmonary; Immunoenzyme techniques; Cells; Anti-tuberculosis therapy

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.003

LAI Xiao-min, Email: laixm@mail.sysu.edu.cn

十二五“傳染病重大專項”分任務(wù)（2012ZX10004903-004- 002）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81271779）

賴小敏，Email：laixm@mail.sysu.edu.cn

2012-12-04