王琦，蔣敬庭，魏文祥

?

B7-H4實時熒光定量PCR檢測方法的建立及其在人胃癌組織中的初步應用

王琦，蔣敬庭，魏文祥

215123 蘇州大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學與生物科學學院細胞與分子生物學教研室（王琦、魏文祥）；213003 常州，蘇州大學附屬第三醫(yī)院腫瘤生物診療中心（蔣敬庭）

建立實時熒光定量 PCR 檢測B7-H4 的方法并初步應用于人胃癌組織。

將 B7-H4 和內(nèi)參 GAPDH 的 PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定正確后克隆入載體 pMD19-T，構建重組質粒標準品，并純化、定量及梯度稀釋，分別建立 B7-H4 和 GAPDH 的標準曲線，應用實時熒光定量 PCR 檢測 8 例人胃癌組織中的 B7-H4 相對于 GAPDH 的表達情況。

B7-H4 的最低檢測拷貝數(shù)為 5.27 拷貝，線性范圍 5.27 × 101~ 5.27 × 107拷貝，標準曲線方程 y = –3.1395 x + 41.805，直線回歸相關系數(shù)= 0.994 904，批間變異系數(shù)范圍 2.39% ~ 3.59%，擴增效率 108.2%；GAPDH 的最低檢測拷貝數(shù)為 38.6 拷貝，線性范圍 3.86 × 102~ 3.86 × 107拷貝，標準曲線方程 y = –3.2436x + 41.083，直線回歸相關系數(shù)= 0.998 913，批間變異系數(shù)范圍 2.26% ~ 3.86%，擴增效率 103.4%。8 例人胃癌組織的 B7-H4 相對于 GAPDH mRNA 表達水平在 0.044 ~ 0.888 之間。

熒光定量 PCR 檢測 B7-H4 的方法具備較高的敏感性和特異性，且系統(tǒng)有良好的重復性和線性范圍。

胃腫瘤； 實時熒光定量 PCR； B7-H4

B7 家族屬于提供第二信號的共刺激分子免疫球蛋白超家族，通過向 T 細胞傳遞協(xié)同刺激信號在 T 細胞充分活化和功能發(fā)揮中起著重要的作用。目前報道發(fā)現(xiàn)的 B7 家族分子共有 7 種，對 B7 家族分子進行系統(tǒng)發(fā)育學比較，可將 B7 家族分子分為三組：I 組包括 B7-1（CD80）、B7-2（CD86）和 B7-H2[1-4]（B7 homolog 2，又稱 GL50、B7h、B7RP-1、ICOS-L）；II 組包括 B7-H1[5-6]（B7 homolog 1，又稱 Programmed death-1 ligand 1 即：PD-L1）和 B7-DC[7]（又稱 Programmed death-1 ligand 2 即：PD-L2）；III 組包括 B7-H3[8]（B7 homolog 3）和 B7-H4[9]（B7 homolog 4 又稱 B7S1 和 B7x）。B7-H4 是 B7 家族中最新發(fā)現(xiàn)的成員，其通過抑制細胞因子的產(chǎn)生、細胞周期的進程、T 細胞的增殖分化，負性調控 T 細胞的免疫應答，在多種惡性腫瘤中有異常表達[10-11]。本課題組前期工作通過胃癌組織免疫組化實驗發(fā)現(xiàn) B7-H4 在胃癌組織中有表達[12]，本研究建立實時熒光定量 PCR 檢測 B7-H4 的方法，并在此基礎上定量檢測胃癌患者癌組織及對應癌旁組織中 B7-H4 的表達水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 2008 年 8 月至 2009 年 3 月在蘇州大學附屬第三醫(yī)院胃腸外科接受手術治療的原發(fā)性胃癌患者 8 例，其中男性 6 例，女性2 例，年齡 51 ~ 74 歲，符合 1990 年《中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范》原發(fā)性胃癌患者診斷標準，臨床病理資料完整。胃癌 TNM 分期：II 期 1 例，III 期 2 例，IV 期 5 例；其中有淋巴結轉移 7 例，無淋巴結轉移 1 例；術前未接受任何放射和化學治療。手術后在胃癌組織原發(fā)灶取病理切片的同時，取癌組織置液氮罐備用。

1.1.2 試劑、引物及探針 Trizol、RT-PCR 和 PCR Master Mix（2 ×）試劑盒購自加拿大 Fermentas 公司；瓊脂糖購自西班牙 Biowest 公司；EB 購自上海生工生物工程公司；DNA marker 購自加拿大 Bio Basic 公司；快速膠回收試劑盒購自美國 Invitrogen 公司；pMD19-T 載體連接試劑盒購自日本 Takara 公司；質粒抽提試劑盒購自德國 Qiagen公司；TaqMan PCR 試劑盒購自美國ABI 公司；依據(jù) GenBank 收錄的 B7-H4 mRNA 全序列 Homo NM-024626.2 與 GAPDH mRNA 全序列 Homo NM-002046，利用引物設計軟件 Primer Premier 5.0 設計引物和 TaqMan 探針，均由上海生工生物工程公司合成。β-actin：上游引物：5' AGC GAG CTA CCC CCA AAG TT 3'；下游引物：5' GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT 3'；擴增片段 285 bp。B7-H4(A)：上游引物：5' GTT TTA GGC TTG GTC CAT GAG T 3'；下游引物：5' GCC AGC ATC TGT GAG TTG C 3'；擴增片段 158 bp。GAPDH：上游引物：5' GGA AGG TGA AGG TCG GAG TC 3'；下游引物：5' CGT TCT CAG CCT TGA CGG T 3'；TaqMan 探針：FAM-TTT GGT CGT ATT GGG CGC CTG-TAMRA；擴增片段 189 bp。B7-H4(B)：上游引物：5' CAC CAG GAT AAC ATC TCT CAG TGA A 3'；下游引物：5' TGG CTT GCA GGG TAG AAT GA 3'；TaqMan 探針：FAM-AAG CTG AAG ATA ATC CCA TCA GGC AT-TAMRA；擴增片段120 bp。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 檢測 B7-H4 在胃癌組織中的表達 Trizol 法提取在液氮中保存的胃癌組織總 RNA，用 Nanodrop 2000 微量紫外分光光度計檢測總 RNA 的濃度和純度（260/280在 2.00 左右為純 RNA）。取各組織樣總 RNA 2.0 μg 為模板，按照逆轉錄試劑盒中的操作說明書逆轉錄 cDNA，以 β-actin 和 B7-H4(A) 引物 PCR，所得 PCR 產(chǎn)物各取 5 μl 進行 2% 瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀觀察和分析電泳結果。

1.2.2 cDNA 目的片段克隆 將 PCR 產(chǎn)物用快速膠回收試劑盒進行割膠回收，利用 pMD19-T 載體連接試劑盒連接膠回收后的目的 DNA 片段和 pMD19-T 載體，12 ~ 16 ℃保溫 8 ~ 16 h。然后將連接產(chǎn)物進行轉化實驗，涂板培養(yǎng)，37 ℃，12 ~16 h。觀察平板挑取 4 ~ 5 個單菌落，分別于 5 ml Amp+LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、225 r/min 振蕩過夜培養(yǎng) 12 ~ 16 h。

1.2.3 重組質粒鑒定 以培養(yǎng)的 1 μl 菌液為模板，10 μmol/L M13 載體通用上下游引物作為 PCR 引物，進行 PCR。陰性對照為相同的反應體系中不加模板菌液。取 10 μl PCR 產(chǎn)物進行 2% 瓊脂糖電泳，觀察條帶位置是否與設計的插入片段一致。條帶位置正確的菌液，用質粒抽提試劑盒分別抽提質粒，取部分測序，blast 比對同源性。

1.2.4 重組質粒濃度測定及標準曲線的建立 經(jīng)測序正確的重組質粒作為標準品，用 Nanodrop 2000 微量紫外分光光度計檢測質粒 DNA 的濃度和純度（260/280在 1.80 左右為純 DNA）。將標準品原液調整至 108拷貝/ml，貯于–80 ℃。標準品原液以 10 倍梯度稀釋成 107~ 101拷貝/ml7 個數(shù)量級的標準品，分別以 B7-H4(B) 和 GAPDH 引物進行實時熒光定量 PCR，各數(shù)量級的樣品均重復 5 次，根據(jù)模板起始拷貝數(shù)和對應的臨界循環(huán)數(shù)制作標準曲線得出標準方程。每條標準曲線分別重復 5 次。

1.2.5 胃癌組織中 B7-H4 相對 RNA 水平的檢測 各胃癌組織樣本提取 RNA，逆轉錄，利用相同的反應體系和反應條件進行實時熒光定量 PCR，得到對應的 Ct 值，根據(jù)建立好的 B7-H4 和 GAPDH 的標準曲線獲得 B7-H4 和 GAPDH 的絕對含量，兩數(shù)值之比即為該胃癌組織中 B7-H4 相對于內(nèi)參 GAPDH 的 RNA 表達水平。

2 結果

2.1 RT-PCR 檢測 B7-H4 在胃癌組織中的表達

結果顯示 3 例胃癌組織內(nèi)參照 β-actin 的表達基本一致，B7-H4 在 3 例胃癌組織中均有表達，但程度不同（圖 1）。

M：DNA 分子量標記；1 ~ 3：B7-H4(A) 和 β-actin 產(chǎn)物大小分別為 158 和 285 bp

Figure 1 Amplified electrophoretogram of B7-H4(A) and β-actin

2.2 重組質粒序列分析

在 ABI3730 全自動測序儀上對提取的重組質粒進行測序。用 Vector NTI advance 10 軟件將重組質粒的測序結果和 B7-H4 和 GAPDH 的基因序列進行比對，達到 100% 的符合率。

2.3 標準曲線的建立及線性檢測范圍

2.3.1 B7-H4 標準曲線的建立及線性檢測范圍 B7-H4 質粒濃度為 15.554 ng/μl，根據(jù)公式[質粒濃度（g/μl）/（660 × 質粒長度bp）]× 6.022 × 1026（拷貝/L），換算出質粒 DNA 濃度為 5.27 × 1012拷貝/L，進行梯度稀釋，依次為 5.27 × 107~ 5.27 × 101拷貝/ml。

B7-H4 標準品的擴增曲線（圖 2）顯示了一組間距相等的平行曲線，107個拷貝數(shù)的標準品從第 15 個循環(huán)開始出現(xiàn)熒光信號，10 個拷貝數(shù)的標準品從第 33 個循環(huán)開始出現(xiàn)熒光信號，表明實時定量 PCR 檢測基因拷貝數(shù)有良好的線性范圍。軟件進一步分析顯示，標準曲線的直線回歸相關系數(shù)= 0.994 904，所有標準品的值基本在一條直線上，沒有任何一個標準品出現(xiàn)大的偏差，表明標準品的制備成功。

B7-H4 標準品實時熒光定量 PCR 標準曲線方程為 y = –3.1395x + 41.805，2= 0.9949。其中x 代表模板量的對數(shù)值（LogC0），y 代表 Ct 值。其線性范圍可達 7 個數(shù)量級，擴增效率 E =（101/3.1395－1）× 100% = 108.2%。

2.3.2 GAPDH 標準曲線的建立及線性檢測范圍 GAPDH 質粒濃度為 11.383 ng/μl，根據(jù)公式[質粒濃度（g/μl）/（660 × 質粒長度bp）] × 6.022 × 1026（拷貝/L）換算出質粒 DNA 濃度為 3.86 × 1012拷貝/L，進行梯度稀釋，依次為 3.86 × 107~ 3.86 × 101拷貝/ml。

GAPDH 標準品的擴增曲線（圖 3）顯示了一組間距相等的平行曲線，107個拷貝數(shù)的標準品從第 14 個循環(huán)開始出現(xiàn)熒光信號，102個拷貝數(shù)的標準品從第 29 個循環(huán)開始出現(xiàn)熒光信號，表明實時定量 PCR 檢測基因拷貝數(shù)有良好的線性范圍。軟件進一步分析顯示，標準曲線的直線回歸相關系數(shù)= 0.998 913，所有標準品的值基本在一條直線上，沒有任何一個標準品出現(xiàn)大的偏差，表明標準品的制備成功。

圖 2 B7-H4 標準品擴增曲線及標準曲線

Figure 2 B7-H4 amplification curve and standard curve

圖 3 GAPDH 標準品擴增曲線及標準曲線

Figure 3 GAPDH amplification curve and standard curve

GAPDH 標準品實時熒光定量 PCR 標準曲線方程為 y = –3.2436 x + 41.083，2= 0.9989。其中x 代表模板量的對數(shù)值（LogC0），y 代表Ct 值。其線性范圍可達 6 個數(shù)量級，擴增效率E =（101/3.2436－1）× 100% = 103.4%。

2.4 標準品的重復性和靈敏度

將 B7-H4 質粒標準品 5.27 × 107拷貝/ml 數(shù)量級的標準品原液依次進行 10 倍梯度稀釋，實時熒光定量 PCR 檢測 Ct 值，重復 5 次，變異系數(shù)范圍在 2.39% ~ 3.59%；將 GAPDH 質粒標準品3.86 × 107拷貝/ml 數(shù)量級的標準品原液進行 10 倍梯度稀釋，實時熒光定量 PCR 檢測 Ct 值，重復5 次，變異系數(shù)范圍在 2.26% ~ 3.86%（表 1）。

表 1 B7-H4 標準品和 GAPDH 標準品的批間重復性

表 2 各胃癌組織標本病例資料

表 3 各胃癌組織及對應癌旁組織 B7-H4 相對 RNA 水平

2.5 胃癌組織中 B7-H4 相對 RNA 水平

8 例胃癌組織標本病例資料（表 2）及根據(jù)建立好的 B7-H4 和 GAPDH 的標準曲線獲得胃癌組織及其相對應的癌旁組織的 B7-H4 和 GAPDH 的 Quantity值（即定量結果），兩數(shù)值之比即為該胃癌組織中 B7-H4 相對于 GAPDH 的 RNA 表達水平，范圍在 0.044 ~ 0.888 之間（表 3）。

3 討論

熒光定量 PCR 技術中，應用最廣泛的是 TaqMan 探針法，其核心是利用 Taq 酶的 5'-3' 外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號[13]。探針法相對于染料法來說排除了引物二聚體產(chǎn)生的熒光信號而干擾目的基因實際所產(chǎn)生的總熒光信號強度。實時熒光定量 PCR 中標準曲線法是最為簡單、準確的定量方法[14-15]，將一系列已知濃度的標準品制成標準曲線，在相同的條件下測得的目的基因熒光信號量同標準曲線進行對比，從而得到目的基因的絕對表達量。標準曲線是以起始拷貝數(shù)的對數(shù)（LogC0）為橫坐標、Ct 值為縱坐標；理論上來說，依次 10 倍稀釋的標準品所得的標準曲線，斜率應該在–3.3 左右。實際上當相關系數(shù) > 0.95，斜率在–3.0 ~ –3.9 之間的標準曲線都被認為是可靠的[16]。本研究應用重組質粒 pMD19-T-B7-H4 連續(xù) 10 倍稀釋后得到的標準曲線為 Ct(B7-H4)= –3.1395 log(DNA 濃度) + 41.805，直線回歸相關系數(shù)= 0.994904；pMD19-T-GAPDH連續(xù)10 倍稀釋后得到的標準曲線為 Ct(GAPDH)= –3.2436 log(DNA 濃度) + 41.083，直線回歸相關系數(shù)= 0.998913，都在公認的可接受范圍內(nèi)。本研究建立的TaqMan 實時熒光定量 PCR 檢測 B7-H4 的方法，能夠檢測低至 5.27 個拷貝的目的基因，并最終產(chǎn)生可高達 7 個數(shù)量級（5.27 × 101~ 5.27 × 107）的動態(tài)檢測范圍；GAPDH 的最低拷貝數(shù)為 38.6，線性范圍為 3.86 × 102~ 3.86 × 107拷貝，B7-H4 和 GAPDH 在各自的范圍內(nèi)，模板濃度與 Ct 之間的相關性均良好。另一個判斷實驗結果優(yōu)劣的重要指標是標準曲線的重復性，主要指標之一是 CV（coefficient of variation，變異系數(shù)）。TaqMan 實時熒光定量 PCR 檢測 B7-H4 和 GAPDH 批間 CV 范圍分別在 2.39% ~ 3.59% 和 2.26% ~ 3.86%，均小于 5%，重復性較好。

本研究處理的胃癌組織標本的例數(shù)相對較少，檢測了 8 例胃癌組織及相應癌旁組織 B7-H4 相對 RNA 水平，最主要的目的在于人協(xié)同刺激分子 B7-H4 實時熒光定量 PCR 檢測方法的建立，并用建立好的體系檢測胃癌組織標本以證明所建立的檢測體系是特異的，成功的。關于 B7-H4 mRNA 相對于 GAPDH mRNA 的表達水平與胃癌組織相關指標（如：TNM 分期、淋巴結轉移情況、浸潤程度等）的關系則有待于檢測大批量的胃癌組織標本并進行統(tǒng)計學處理后得出結論。

本研究結果表明 B7-H4 普遍表達于胃癌組織中，且表達強度相對于與管家基因 GAPDH 的范圍在0.044 ~ 0.888，相應癌旁組織的表達量普遍低于或與癌組織接近，說明 B7-H4 在胃癌組織中的表達量相對還是比較高的，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到重要作用，和腫瘤的侵襲也有一定的關系。在乳腺癌中[17]，正常的乳腺細胞和惡性的乳腺癌細胞的 B7-H4 表達譜有著很大的差異，過表達 B7-H4 的乳腺癌細胞可以幫助其逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)測。B7-H4 的 mRNA 和蛋白在人漿液性卵巢癌和乳腺癌[18]中高表達，而在正常組織中低表達或不表達，B7-H4 的蛋白在癌細胞表面廣泛糖基化，促進上皮細胞的惡性轉化，保護上皮細胞的“失巢凋亡”，在人卵巢癌細胞系中過表達 B7-H4 還可以促進在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。非小細胞肺癌[19]中高表達的 B7-H4 在有淋巴結轉移的病例中普遍存在。同時表達 B7-H4 和 B7-H1 的腎細胞癌患者有著更高的死亡風險，因此可能是腎細胞癌的預后的一個重要的標志物，可以作為腫瘤細胞和腫瘤新生血管的靶標協(xié)助腫瘤的免疫治療[20]。隨著對 B7-H4 研究的深入，B7-H4 過表達被認為是胃癌預后差的一個關鍵因素[21]，B7-H4 的激活有可能作為腫瘤的預后因素或者作為腫瘤治療的靶分子。

[1] Wang S, Zhu G, Chapoval AI, et al. Costimulation of T cells by B7-H2, a B7-like molecule that binds ICOS. Blood, 2000, 96(8):2808-2813.

[2] Ling V, Wu PW, Finnerty HF, et al. Cutting edge: identification of GL50, a novel B7-like protein that functionally binds to ICOS receptor. J Immunol, 2000, 164(4):1653-1657.

[3] Swallow MM, Wallin JJ, Sha WC. B7h, a novel costimulatory homolog of B7.1 and B7.2, is induced by TNFalpha. Immunity, 1999, 11(4):423-432.

[4] Yoshinaga SK, Whoriskey JS, Khare SD, et al. T-cell co-stimulation through B7RP-1 and ICOS. Nature, 1999, 402(6763):827-832.

[5] Dong H, Zhu G, Tamada K, et al. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat Med, 1999, 5(12):1365-1369.

[6] Freeman GJ, Long AJ, Iwai Y, et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J Exp Med, 2000, 192(7):1027-1034.

[7] Latchman Y, Wood CR, Chernova T, et al. PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation. Nat Immunol, 2001, 2(3): 261-268.

[8] Chapoval AI, Ni J, Lau JS, et al. B7-H3: a costimulatory molecule for T cell activation and IFN-gamma production. Nat Immunol, 2001, 2(3):269-274.

[9] Zang X, Loke P, Kim J, et al. B7x: a widely expressed B7 family member that inhibits T cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(18):10388-10392.

[10] Li C, Jiang JT, Wu CP. Study progression of costimulatory molecule B7-H4 and tumor microenvironment. Chin Clin Oncol, 2012, 17(5): 466-469. (in Chinese)

李翀, 蔣敬庭, 吳昌平. 協(xié)同刺激分子B7-H4與腫瘤微環(huán)境的研究進展. 臨床腫瘤學雜志, 2012, 17(5):466-469.

[11] Hu WW, Jiang JT, Wu CP. Experssion of B7-H4 and Its Significance in Human Maligant Tumor. Med Recapitulate, 2010, 16(1):52-54. (in Chinese)

胡文蔚, 蔣敬庭, 吳昌平. 協(xié)同刺激分子B7-H4在惡性腫瘤中的表達意義. 醫(yī)學綜述, 2010, 16(1):52-54.

[12] Jiang JT, Wu CP, Shen YP, et al. Experssion of costimulatory molecule B7-H4 in the gastric tissues and its correlation with prognosis. Chin

J Exp Surg, 2009, 26(9):1155-1158. (in Chinese)

蔣敬庭, 吳昌平, 沈月平, 等. 共刺激分子B7-H4在胃癌組織中表達及其與預后的關系. 中華實驗外科雜志, 2009, 26(9):1155-1158.

[13] Thiery JP. Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. Nat Rev Cancer, 2002, 2(6):442-454.

[14] Ke LD, Chen Z, Yung WK. A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol Cell Probes, 2000, 14(2):127-135.

[15] Vandenbroucke II, Vandesompele J, Paepe AD, et al. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res, 2001, 29(13): E68-E88.

[16] van der Velden VH, Hochhaus A, Cazzaniga G, et al. Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects. Leukemia, 2003, 17(6):1013-1034.

[17] Mugler KC, Singh M, Tringler B, et al. B7-h4 expression in a range of breast pathology: correlation with tumor T-cell infiltration. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2007, 15(4):363-370.

[18] Salceda S, Tang T, Kmet M, et al. The immunomodulatory protein B7-H4 is overexpressed in breast and ovarian cancers and promotes epithelial cell transformation. Exp Cell Res, 2005, 306(1):128-141.

[19] Sun Y, Wang Y, Zhao J, et al. B7-H3 and B7-H4 expression in non-small-cell lung cancer. Lung Cancer, 2006, 53(2):143-151.

[20] Krambeck AE, Thompson RH, Dong H, et al. B7-H4 expression in renal cell carcinoma and tumor vasculature: associations with cancer progression and survival. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(27): 10391-10396.

[21] Jiang J, Zhu Y, Wu C, et al. Tumor expression of B7-H4 predicts poor survival of patients suffering from gastric cancer. Cancer Immunol Immunother, 2010, 59(11):1707-1714.

Quantification of B7-H4 with real-time fluorescent PCR and its preliminary application in gastric carcinoma

WANG Qi, JIANG Jing-ting, WEI Wen-xiang

Department of Cell Biology, School of Biology and Basic Medicine Science, Medical College, Soochow University, Suzhou 215123, China (WANG Qi, WEI Wen-xiang); Department of Tumor Biological Treatment, The Third Affiliated Hospitial of Soochow University, Changzhou 213003, China (JIANG Jing-ting)

Toestablish a real-time fluorescent polymerase chain reaction for quantifying B7-H4 and detect the expression of B7-H4 in human gastric carcinoma.

The B7-H4 and internal reference gene GAPDH fragments in correct sequence from RT-PCR were cloned into pMD19-T vector, and recombinant plasmids were purified and quantified by spectrophotometry. Standard curves was established by using a serial dilution of quantified plasmids in order to measure B7-H4 and GAPDH. Real-time fluorescent PCR was used to quantify the expression level of B7-H4 relative to GAPDH in 8 gastric carcinoma tissues.

For B7-H4, the detection of the minimum copy number was 5.27 copies. The linear range of 5.27 × 101~5.27 × 107copies of the standard curve equation (y = -3.1395 x + 41.805) was found and the correlation coefficient for 0.994 904 was obtained. The inter-assay CV ranged from 2.39% to 3.59% and the amplification efficiency was 108.2%. For GAPDH, the detection of the minimum copy number was 38.6 copies. The linear range of 3.86 × 102to 3.86 × 107copies of the standard curve equation (y = –3.2436 x + 41.083) was found and the correlation coefficient of 0.998 913 was obtained. The inter-assay CV ranged from 2.26% to 3.86% and the amplification efficiency was 103.4%. mRNA levels of B7-H4 relative to GAPDH in 8 gastric carcinoma tissues were between 0.044 and 0.888.

The real-time fluorescent quantitative PCR system established for quantifying B7-H4 is rapid, specific, sensitive and accurate. The standard system is repeatable and has a good linear range.

Stomach neoplasms; Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction; B7-H4

WEI Wen-xiang, Email: wenxiangw@suda.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.001

國家自然科學基金（81171653、30972703）；江蘇省自然科學基金（BK2011246、BK2011247）；“六大人才高峰”第六批資金資助項目（BRA2010037）；常州市科技支撐計劃（社會發(fā)展）計劃基金（CJ20112020、CZ20110024、CS20102020）

魏文祥，Email：wenxiangw@suda.edu.cn

2012-12-17