朱天輝，李姝江，韓 珊，譙天敏，張麗娜，邵寶林

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，四川 雅安 625014)

撐×綠雜交竹是南方重要的經(jīng)濟(jì)用材竹，也是四川等地引種發(fā)展的主要經(jīng)濟(jì)竹種之一［1］。近年來，由褐堅(jiān)殼菌［Rosellinia necatrix (Hart.)Berl.］引起的雜交竹白紋羽?。?］導(dǎo)致根系腐爛、竹整株枯死，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，極大地威脅著長(zhǎng)江中上游地區(qū)退耕還林進(jìn)程和生態(tài)屏障建設(shè)［1，3］。目前主要采用化學(xué)防治和營(yíng)林技術(shù)，而生物防治措施研究尚未涉及。化學(xué)防治雖是一種有效的防治手段，但存在病原菌抗藥性、環(huán)境與食品安全、藥害等許多實(shí)際問題，一些化學(xué)殺菌劑在許多發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)已嚴(yán)格限制使用［4，5］。而與環(huán)境友好的生物農(nóng)藥越來越受到人們的青睞，是未來農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要組成部分［6－9］。該病土傳根病侵染循環(huán)不明顯，發(fā)病環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，最適宜于生物防治。本文以健康雜交竹根際土中芽孢桿菌為篩選對(duì)象，通過初篩、復(fù)篩、盆栽試驗(yàn)獲得目標(biāo)菌株，在此基礎(chǔ)上，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后進(jìn)行生防研究，以期為環(huán)保型生防制劑研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

供試病原菌為雜交竹白紋羽病菌［Rosellinia necatrix (Hart.)Berl.］，分離于雅安某雜交竹林地。

1.2 芽孢桿菌的分離和純化

取健康雜交竹根際土壤(表層10 cm 以下)裝入無菌樣品袋帶回實(shí)驗(yàn)室，備用。每份樣品稱量10 g 轉(zhuǎn)至裝有90 mL 生理鹽水和少量玻璃珠的三角瓶中，充分混勻后制成土壤懸浮液，放入100 ℃水浴中加熱5 min。冷卻后，無菌條件下取1 mL 加入裝有9 mL 無菌水的試管中，充分混勻得到10－2的樣品稀釋液，按照此法依次稀釋，分別獲得10－3、10－4、10－5和10－6的土壤稀釋液，取10－3、10－4、10－5和10－6的土壤稀釋液各0.1 mL，分別采用稀釋平板涂布法［10］將其涂布在LB 培養(yǎng)基上，倒置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，48 h 后根據(jù)菌落形態(tài)特征，挑取單菌落進(jìn)行平板劃線，以保證菌落純度，分別保存于斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.3 生防芽孢桿菌的初篩

將斜面培養(yǎng)的產(chǎn)孢白紋羽病菌用無菌水洗出分生孢子，用移液槍取1 mL 加入無菌培養(yǎng)皿中，然后倒入45 ℃左右的PDA 培養(yǎng)基15 mL，充分混合均勻，冷卻后制成含菌平板。采用點(diǎn)菌法［11］，接種分離獲得的芽孢桿菌，倒置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，24 h 后觀察有無抑菌圈產(chǎn)生進(jìn)行生防芽孢桿菌的篩選，并做好記錄。

1.4 發(fā)酵液活性的測(cè)定(復(fù)篩)

1.3 篩選出抑菌活性較強(qiáng)的芽孢桿菌菌株，活化后分別將其接種于LB 肉湯培養(yǎng)液中，30 ℃，120 r·min－1的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h 后，作為種子液以1∶1比例加入含有葡萄糖的LB 肉湯培養(yǎng)基，30℃，120 r·min－1的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h 后取出，用牛津杯法和打孔法［12］進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，檢測(cè)發(fā)酵液是否有抑菌活性。

1.5 發(fā)酵濾液活性的測(cè)定

用移液槍吸取5 mL 經(jīng)過24 h 培養(yǎng)的種子液，加入裝有45 mL 含葡萄糖的LB 肉湯培養(yǎng)液的250 mL 三角瓶中，30 ℃，120 r·min－1的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，36 h 后，經(jīng)3 000 r·min－1，離心5 min 后，取上清液，用0.2 μm 細(xì)菌過濾器過濾，獲得無細(xì)胞發(fā)酵濾液。取0.1 mL 病原菌稀釋液涂布于平板上，采用牛津杯法、打孔法［12］測(cè)定發(fā)酵濾液對(duì)病原菌的抑菌活性，重復(fù)3次，并設(shè)對(duì)照，2 d 后測(cè)量抑菌圈直徑。

同時(shí)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行121 ℃，15 min 高溫處理，按照上述方法檢測(cè)拮抗活性的有無。

結(jié)合1.3 和1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出最佳生防芽孢桿菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.6 盆栽試驗(yàn)

選取一年生盆雜交竹為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，PDA 斜面白紋羽病菌分生孢子(106cfu·mL－1)接種根系一周后，用篩選出的生防菌經(jīng)發(fā)酵后，取其發(fā)酵液采用灌根法分不同濃度(原液、50 倍、100 倍、200 倍、500倍、1 000倍)對(duì)竹苗進(jìn)行灌根處理，每盆200 mL，并以無菌水作對(duì)照，重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)雜交竹發(fā)病情況。

1.7 生防芽孢桿菌的鑒定

1.7.1 形態(tài)特征觀察

將待測(cè)菌株接種在LB 瓊脂培養(yǎng)基上，24 h 后觀察菌落顏色、質(zhì)地、光學(xué)特性、色素、邊緣及形態(tài)。

1.7.2 個(gè)體形態(tài)觀察

對(duì)待測(cè)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色和菌體形狀進(jìn)行觀察［13］。

革蘭氏染色:取一張干凈的載玻片，在其中央滴加一滴無菌水，用接種環(huán)蘸取少量培養(yǎng)18 h～24 h的待測(cè)芽孢桿菌進(jìn)行涂片固定，待風(fēng)干后在涂片位置滴加結(jié)晶紫進(jìn)行初染，1 min 后用自來水進(jìn)行沖洗，待無明顯紫色后甩掉多余水分，滴加碘液進(jìn)行媒染，1 min 后用自來水進(jìn)行沖洗，甩掉多余水分后滴加95%的酒精進(jìn)行脫色，脫色時(shí)需輕輕晃動(dòng)，20 s后用自來水沖洗，去掉多余水分滴加番紅進(jìn)行復(fù)染，2 min 后用自來水沖洗，去掉多余水分待風(fēng)干后進(jìn)行鏡檢。如果鏡檢菌體顏色為紫色，說明待測(cè)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌;顏色為紅色，待測(cè)菌為革蘭氏陰性菌。

芽孢染色:在干凈的載玻片中央滴加少量無菌水，用接種環(huán)蘸取培養(yǎng)72 h 后的待測(cè)菌進(jìn)行涂片固定，在涂片位置滴加甲醇，30 s 后傾掉并用酒精燈火焰進(jìn)行干燥，滴加番紅進(jìn)行染色，在酒精燈火焰上方加熱(略見蒸汽時(shí)為宜，防止染液過快蒸發(fā))，維持1 min 稍冷卻后去掉多余染液，用自來水進(jìn)行沖洗，待風(fēng)干后鏡檢。

1.7.3 生理生化鑒定

根據(jù)菌體和菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色等，結(jié)合生理生化鑒別試驗(yàn)，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第8 版)［14］進(jìn)行鑒定。

1.8 田間防治

1.8.1 B2 液體制劑制作

①一級(jí)斜面種子:常規(guī)方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基(牛肉膏7 g，蛋白胨10 g，NaCl5 g，瓊脂17 g，水1 000 mL)，接種蠟樣芽孢桿菌B2 后在26℃～28 ℃下培養(yǎng)24 h～36 h 制成一級(jí)種子。

②二級(jí)液體種子:營(yíng)養(yǎng)肉質(zhì)培養(yǎng)液(牛肉膏7 g，蛋白胨10 g，NaCl5 g，竹根浸漬液1 000 mL)經(jīng)高壓滅菌后，按100 mL 液體盛于300 mL 三角瓶比例(通氧控制)裝瓶，在無菌狀態(tài)接種蠟樣芽孢桿菌B2斜面種子，每瓶接種兩支斜面種子，溫度26 ℃～28℃，初始pH 值6.0，120 r·min－1振蕩培養(yǎng)36h，制成蠟樣芽孢桿菌B2 液體種子。

③液體發(fā)酵:營(yíng)養(yǎng)肉質(zhì)培養(yǎng)液(牛肉膏7 g，蛋白胨10 g，NaCl5 g，竹根浸漬液1 000 mL)經(jīng)高壓滅菌后，按200 mL 液體盛于500 mL 三角瓶比例(通氧控制)裝瓶，在無菌狀態(tài)接種B2 液體種子，接種量10%(體積比)，溫度26 ℃～28 ℃，初始pH 值6.0，120 r·min－1振蕩培養(yǎng)72 h，制成B2 液體制劑。

1.8.2 田間預(yù)防與治療試驗(yàn)

①預(yù)防處理:選擇未發(fā)病雜交竹用上述液體制劑0～1 000倍(體積比)稀釋度沿根系幅面灌根，每株100 mL，每年春季施用一次，重復(fù)6次，用清水和70%甲基托布津1 000倍分別作對(duì)照。

②防治處理:選擇發(fā)病雜交竹按0～1 000 倍(體積比)稀釋度沿根系幅面灌根及附近土壤淋灌，每株200 mL，春、夏各1次，連續(xù)3 a，用清水和70%甲基托布津800 倍分別作對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防芽孢桿菌的初篩與復(fù)篩

分離共獲得36株芽孢桿菌，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、邊緣、光學(xué)特性以及是否產(chǎn)生色素進(jìn)行合并后，共25株(表1)。分別通過點(diǎn)菌法進(jìn)行拮抗測(cè)定，篩選出雜交竹白紋羽病菌具有較強(qiáng)拮抗做用的菌株4株。抑菌圈直徑達(dá)到5 mm 以上的共3株，其中B2菌株拮抗作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑均達(dá)到14 mm 左右;其次是B21，抑菌圈直徑均達(dá)到8 mm 左右;B2A抑菌圈最小，僅達(dá)到3 mm。

待測(cè)生防菌株發(fā)酵后，靜置，取上清液，3500 r·min－1，離心5 min，取上清液分別采用打孔法、牛津杯法對(duì)指示病原菌進(jìn)行拮抗測(cè)定。

采用打孔法，將指示病原菌分生孢子接種在平板上，直徑5 mm 打孔器打孔后，在孔中加入待測(cè)的生防菌發(fā)酵液，測(cè)得B2A、B21 基本不產(chǎn)生抑菌圈，而B2 菌株抑菌圈直徑達(dá)到20 mm ±0.6 mm，說明B2 對(duì)雜交竹白紋羽病菌具有較好的抑制作用。

采用牛津杯法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行拮抗活性的測(cè)定，測(cè)得B2 具有一定的拮抗活性，發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑菌圈直徑達(dá)到13 mm±0.5 mm，而B2A 和B21 基本看不出抑菌圈，發(fā)酵液無抑菌活性。

表1 生防菌株初篩結(jié)果Table 1 Screening results of biocontrol bacteria

2.2 目標(biāo)芽孢桿菌生物活性

B2 菌株經(jīng)發(fā)酵后，取其上清液用細(xì)菌過濾器(直徑0.2 μm)過濾后獲得無菌發(fā)酵濾液，用打孔法和牛津杯法分別測(cè)定抑菌活性測(cè)定。結(jié)果表明，B2 菌株經(jīng)發(fā)酵后獲得無細(xì)胞發(fā)酵濾液對(duì)指示病原菌表現(xiàn)出一定的拮抗效果，打孔法和牛津杯法產(chǎn)生的抑菌圈帶寬分別為4 mm±0.5 mm 和3 mm±0.2 mm。發(fā)酵濾液經(jīng)過121 ℃，15 min 高溫處理后仍具有拮抗活性，說明抑菌代謝產(chǎn)物具有耐熱性。

2.3 目標(biāo)芽孢桿菌盆栽生防效果

B2 發(fā)酵液經(jīng)稀釋后，表現(xiàn)出不同的防治效果，原液至200 倍以下效果顯著，特別是50 倍以下，可基本上控制病害不發(fā)生(表2)。

表2 盆栽試驗(yàn)30 d 后菌株B2 的防治效果Table 2 Control effect of B2 after 30 days of pot experiment

2.4 目標(biāo)芽孢桿菌的分類地位

B2 菌株經(jīng)LB 瓊脂平板培養(yǎng)24 h 后，菌落扁平，顏色為乳白色，不透明，表面略粗糙，呈白蠟狀，質(zhì)地軟，略有光澤，無色素，外形不規(guī)則近圓形，中部突起，邊緣不整齊。顯微鏡下革蘭氏染色呈陽(yáng)性，菌體呈桿狀，末端方，成短或長(zhǎng)鏈，芽孢橢圓中生或近中。B2 芽孢桿菌的生理生化特征見表3，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第8 版)》，根據(jù)B2 菌株菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色和生理生化測(cè)定結(jié)果(表3)，初步確定為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus。

表3 B2 菌株的生理生化特征Table 3 Physiological-biological characteristics of B2

2.5 蠟樣芽孢桿菌田間生防效果

在預(yù)防處理中，未發(fā)病雜交竹用上述液體制劑100 倍～200 倍(體積比)稀釋度沿根系幅面灌根，每株100 mL，每年春季施用1次，可預(yù)防白紋羽病發(fā)生，且優(yōu)于甲基托布津，甲基托布津預(yù)防效果與1000 倍生防制劑相當(dāng)(表4)。

在防治處理中，發(fā)病雜交竹按50 倍～100 倍(體積比)稀釋度沿根系幅面灌根及附近土壤淋灌，每株200 mL，春、夏各1次，連續(xù)3 a，可效治療白紋羽病，且優(yōu)于甲基托布津，而甲基托布津治療效果與500 倍生防制劑相當(dāng)(表5)。

表4 B2 預(yù)防效果(1 a 生未發(fā)病雜交竹林地)Table 4 Prevent effect of B2 (one year old non-diseased hybrid bamboo)

表5 B2 治療效果(處理3 a 后發(fā)病雜交竹林地)Table 5 Control effect of B2 (diseased hybrid bamboo after treated for 3 years)

3 結(jié)論與討論

眾多研究表明，細(xì)菌有著其他微生物所不具備的優(yōu)點(diǎn)，如種類和數(shù)量龐大，繁殖快速，作用方式多等等，以致在植物病害生物防治中有著非常重要的地位。目前，有18個(gè)屬的細(xì)菌在植物病害生物防治上有潛力［15］，特別是芽孢桿菌屬的細(xì)菌，由于其抗逆性強(qiáng)、商貯性好，更是受到生防工作者重視。本文所分離的蠟樣芽孢桿菌，對(duì)雜交竹白紋羽病菌拮抗作用強(qiáng)，能抗高溫、干燥，易繁殖，是一種有較高開發(fā)價(jià)值的生防菌。

植物根標(biāo)存在大量的有益微生物，現(xiàn)已從多種植物根際分離到對(duì)植物病害具有良好抑制效果的微生物［16～19］，因此利用微生物防治撐×綠雜交竹白紋羽病可成為一種新途徑，本文從雜交竹根際獲得的芽孢桿菌，能很快定殖、占領(lǐng)土壤空間，排擠病原物，其防效持續(xù)、穩(wěn)定，優(yōu)于化學(xué)農(nóng)藥(甲基托布津)的效果。

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