朱天輝,李姝江,韓 珊,譙天敏,張麗娜,邵寶林
(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,四川 雅安 625014)
撐×綠雜交竹是南方重要的經(jīng)濟(jì)用材竹,也是四川等地引種發(fā)展的主要經(jīng)濟(jì)竹種之一[1]。近年來,由褐堅(jiān)殼菌[Rosellinia necatrix (Hart.)Berl.]引起的雜交竹白紋羽?。?]導(dǎo)致根系腐爛、竹整株枯死,造成較大的經(jīng)濟(jì)損失,極大地威脅著長(zhǎng)江中上游地區(qū)退耕還林進(jìn)程和生態(tài)屏障建設(shè)[1,3]。目前主要采用化學(xué)防治和營(yíng)林技術(shù),而生物防治措施研究尚未涉及。化學(xué)防治雖是一種有效的防治手段,但存在病原菌抗藥性、環(huán)境與食品安全、藥害等許多實(shí)際問題,一些化學(xué)殺菌劑在許多發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)已嚴(yán)格限制使用[4,5]。而與環(huán)境友好的生物農(nóng)藥越來越受到人們的青睞,是未來農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要組成部分[6-9]。該病土傳根病侵染循環(huán)不明顯,發(fā)病環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定,最適宜于生物防治。本文以健康雜交竹根際土中芽孢桿菌為篩選對(duì)象,通過初篩、復(fù)篩、盆栽試驗(yàn)獲得目標(biāo)菌株,在此基礎(chǔ)上,經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后進(jìn)行生防研究,以期為環(huán)保型生防制劑研究提供技術(shù)支撐。
供試病原菌為雜交竹白紋羽病菌[Rosellinia necatrix (Hart.)Berl.],分離于雅安某雜交竹林地。
取健康雜交竹根際土壤(表層10 cm 以下)裝入無菌樣品袋帶回實(shí)驗(yàn)室,備用。每份樣品稱量10 g 轉(zhuǎn)至裝有90 mL 生理鹽水和少量玻璃珠的三角瓶中,充分混勻后制成土壤懸浮液,放入100 ℃水浴中加熱5 min。冷卻后,無菌條件下取1 mL 加入裝有9 mL 無菌水的試管中,充分混勻得到10-2的樣品稀釋液,按照此法依次稀釋,分別獲得10-3、10-4、10-5和10-6的土壤稀釋液,取10-3、10-4、10-5和10-6的土壤稀釋液各0.1 mL,分別采用稀釋平板涂布法[10]將其涂布在LB 培養(yǎng)基上,倒置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,48 h 后根據(jù)菌落形態(tài)特征,挑取單菌落進(jìn)行平板劃線,以保證菌落純度,分別保存于斜面?zhèn)溆谩?/p>
將斜面培養(yǎng)的產(chǎn)孢白紋羽病菌用無菌水洗出分生孢子,用移液槍取1 mL 加入無菌培養(yǎng)皿中,然后倒入45 ℃左右的PDA 培養(yǎng)基15 mL,充分混合均勻,冷卻后制成含菌平板。采用點(diǎn)菌法[11],接種分離獲得的芽孢桿菌,倒置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,24 h 后觀察有無抑菌圈產(chǎn)生進(jìn)行生防芽孢桿菌的篩選,并做好記錄。
1.3 篩選出抑菌活性較強(qiáng)的芽孢桿菌菌株,活化后分別將其接種于LB 肉湯培養(yǎng)液中,30 ℃,120 r·min-1的恒溫?fù)u床中培養(yǎng),培養(yǎng)24 h 后,作為種子液以1∶1比例加入含有葡萄糖的LB 肉湯培養(yǎng)基,30℃,120 r·min-1的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h 后取出,用牛津杯法和打孔法[12]進(jìn)行抑菌試驗(yàn),檢測(cè)發(fā)酵液是否有抑菌活性。
用移液槍吸取5 mL 經(jīng)過24 h 培養(yǎng)的種子液,加入裝有45 mL 含葡萄糖的LB 肉湯培養(yǎng)液的250 mL 三角瓶中,30 ℃,120 r·min-1的恒溫?fù)u床中培養(yǎng),36 h 后,經(jīng)3 000 r·min-1,離心5 min 后,取上清液,用0.2 μm 細(xì)菌過濾器過濾,獲得無細(xì)胞發(fā)酵濾液。取0.1 mL 病原菌稀釋液涂布于平板上,采用牛津杯法、打孔法[12]測(cè)定發(fā)酵濾液對(duì)病原菌的抑菌活性,重復(fù)3次,并設(shè)對(duì)照,2 d 后測(cè)量抑菌圈直徑。
同時(shí)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行121 ℃,15 min 高溫處理,按照上述方法檢測(cè)拮抗活性的有無。
結(jié)合1.3 和1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果,篩選出最佳生防芽孢桿菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
選取一年生盆雜交竹為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,PDA 斜面白紋羽病菌分生孢子(106cfu·mL-1)接種根系一周后,用篩選出的生防菌經(jīng)發(fā)酵后,取其發(fā)酵液采用灌根法分不同濃度(原液、50 倍、100 倍、200 倍、500倍、1 000倍)對(duì)竹苗進(jìn)行灌根處理,每盆200 mL,并以無菌水作對(duì)照,重復(fù)3次,統(tǒng)計(jì)雜交竹發(fā)病情況。
1.7.1 形態(tài)特征觀察
將待測(cè)菌株接種在LB 瓊脂培養(yǎng)基上,24 h 后觀察菌落顏色、質(zhì)地、光學(xué)特性、色素、邊緣及形態(tài)。
1.7.2 個(gè)體形態(tài)觀察
對(duì)待測(cè)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色和菌體形狀進(jìn)行觀察[13]。
革蘭氏染色:取一張干凈的載玻片,在其中央滴加一滴無菌水,用接種環(huán)蘸取少量培養(yǎng)18 h~24 h的待測(cè)芽孢桿菌進(jìn)行涂片固定,待風(fēng)干后在涂片位置滴加結(jié)晶紫進(jìn)行初染,1 min 后用自來水進(jìn)行沖洗,待無明顯紫色后甩掉多余水分,滴加碘液進(jìn)行媒染,1 min 后用自來水進(jìn)行沖洗,甩掉多余水分后滴加95%的酒精進(jìn)行脫色,脫色時(shí)需輕輕晃動(dòng),20 s后用自來水沖洗,去掉多余水分滴加番紅進(jìn)行復(fù)染,2 min 后用自來水沖洗,去掉多余水分待風(fēng)干后進(jìn)行鏡檢。如果鏡檢菌體顏色為紫色,說明待測(cè)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌;顏色為紅色,待測(cè)菌為革蘭氏陰性菌。
芽孢染色:在干凈的載玻片中央滴加少量無菌水,用接種環(huán)蘸取培養(yǎng)72 h 后的待測(cè)菌進(jìn)行涂片固定,在涂片位置滴加甲醇,30 s 后傾掉并用酒精燈火焰進(jìn)行干燥,滴加番紅進(jìn)行染色,在酒精燈火焰上方加熱(略見蒸汽時(shí)為宜,防止染液過快蒸發(fā)),維持1 min 稍冷卻后去掉多余染液,用自來水進(jìn)行沖洗,待風(fēng)干后鏡檢。
1.7.3 生理生化鑒定
根據(jù)菌體和菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色等,結(jié)合生理生化鑒別試驗(yàn),參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第8 版)[14]進(jìn)行鑒定。
1.8.1 B2 液體制劑制作
①一級(jí)斜面種子:常規(guī)方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基(牛肉膏7 g,蛋白胨10 g,NaCl5 g,瓊脂17 g,水1 000 mL),接種蠟樣芽孢桿菌B2 后在26℃~28 ℃下培養(yǎng)24 h~36 h 制成一級(jí)種子。
②二級(jí)液體種子:營(yíng)養(yǎng)肉質(zhì)培養(yǎng)液(牛肉膏7 g,蛋白胨10 g,NaCl5 g,竹根浸漬液1 000 mL)經(jīng)高壓滅菌后,按100 mL 液體盛于300 mL 三角瓶比例(通氧控制)裝瓶,在無菌狀態(tài)接種蠟樣芽孢桿菌B2斜面種子,每瓶接種兩支斜面種子,溫度26 ℃~28℃,初始pH 值6.0,120 r·min-1振蕩培養(yǎng)36h,制成蠟樣芽孢桿菌B2 液體種子。
③液體發(fā)酵:營(yíng)養(yǎng)肉質(zhì)培養(yǎng)液(牛肉膏7 g,蛋白胨10 g,NaCl5 g,竹根浸漬液1 000 mL)經(jīng)高壓滅菌后,按200 mL 液體盛于500 mL 三角瓶比例(通氧控制)裝瓶,在無菌狀態(tài)接種B2 液體種子,接種量10%(體積比),溫度26 ℃~28 ℃,初始pH 值6.0,120 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h,制成B2 液體制劑。
1.8.2 田間預(yù)防與治療試驗(yàn)
①預(yù)防處理:選擇未發(fā)病雜交竹用上述液體制劑0~1 000倍(體積比)稀釋度沿根系幅面灌根,每株100 mL,每年春季施用一次,重復(fù)6次,用清水和70%甲基托布津1 000倍分別作對(duì)照。
②防治處理:選擇發(fā)病雜交竹按0~1 000 倍(體積比)稀釋度沿根系幅面灌根及附近土壤淋灌,每株200 mL,春、夏各1次,連續(xù)3 a,用清水和70%甲基托布津800 倍分別作對(duì)照。
分離共獲得36株芽孢桿菌,根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、邊緣、光學(xué)特性以及是否產(chǎn)生色素進(jìn)行合并后,共25株(表1)。分別通過點(diǎn)菌法進(jìn)行拮抗測(cè)定,篩選出雜交竹白紋羽病菌具有較強(qiáng)拮抗做用的菌株4株。抑菌圈直徑達(dá)到5 mm 以上的共3株,其中B2菌株拮抗作用最強(qiáng),抑菌圈直徑均達(dá)到14 mm 左右;其次是B21,抑菌圈直徑均達(dá)到8 mm 左右;B2A抑菌圈最小,僅達(dá)到3 mm。
待測(cè)生防菌株發(fā)酵后,靜置,取上清液,3500 r·min-1,離心5 min,取上清液分別采用打孔法、牛津杯法對(duì)指示病原菌進(jìn)行拮抗測(cè)定。
采用打孔法,將指示病原菌分生孢子接種在平板上,直徑5 mm 打孔器打孔后,在孔中加入待測(cè)的生防菌發(fā)酵液,測(cè)得B2A、B21 基本不產(chǎn)生抑菌圈,而B2 菌株抑菌圈直徑達(dá)到20 mm ±0.6 mm,說明B2 對(duì)雜交竹白紋羽病菌具有較好的抑制作用。
采用牛津杯法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行拮抗活性的測(cè)定,測(cè)得B2 具有一定的拮抗活性,發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑菌圈直徑達(dá)到13 mm±0.5 mm,而B2A 和B21 基本看不出抑菌圈,發(fā)酵液無抑菌活性。
表1 生防菌株初篩結(jié)果Table 1 Screening results of biocontrol bacteria
B2 菌株經(jīng)發(fā)酵后,取其上清液用細(xì)菌過濾器(直徑0.2 μm)過濾后獲得無菌發(fā)酵濾液,用打孔法和牛津杯法分別測(cè)定抑菌活性測(cè)定。結(jié)果表明,B2 菌株經(jīng)發(fā)酵后獲得無細(xì)胞發(fā)酵濾液對(duì)指示病原菌表現(xiàn)出一定的拮抗效果,打孔法和牛津杯法產(chǎn)生的抑菌圈帶寬分別為4 mm±0.5 mm 和3 mm±0.2 mm。發(fā)酵濾液經(jīng)過121 ℃,15 min 高溫處理后仍具有拮抗活性,說明抑菌代謝產(chǎn)物具有耐熱性。
B2 發(fā)酵液經(jīng)稀釋后,表現(xiàn)出不同的防治效果,原液至200 倍以下效果顯著,特別是50 倍以下,可基本上控制病害不發(fā)生(表2)。
表2 盆栽試驗(yàn)30 d 后菌株B2 的防治效果Table 2 Control effect of B2 after 30 days of pot experiment
B2 菌株經(jīng)LB 瓊脂平板培養(yǎng)24 h 后,菌落扁平,顏色為乳白色,不透明,表面略粗糙,呈白蠟狀,質(zhì)地軟,略有光澤,無色素,外形不規(guī)則近圓形,中部突起,邊緣不整齊。顯微鏡下革蘭氏染色呈陽(yáng)性,菌體呈桿狀,末端方,成短或長(zhǎng)鏈,芽孢橢圓中生或近中。B2 芽孢桿菌的生理生化特征見表3,參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第8 版)》,根據(jù)B2 菌株菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色和生理生化測(cè)定結(jié)果(表3),初步確定為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus。
表3 B2 菌株的生理生化特征Table 3 Physiological-biological characteristics of B2
在預(yù)防處理中,未發(fā)病雜交竹用上述液體制劑100 倍~200 倍(體積比)稀釋度沿根系幅面灌根,每株100 mL,每年春季施用1次,可預(yù)防白紋羽病發(fā)生,且優(yōu)于甲基托布津,甲基托布津預(yù)防效果與1000 倍生防制劑相當(dāng)(表4)。
在防治處理中,發(fā)病雜交竹按50 倍~100 倍(體積比)稀釋度沿根系幅面灌根及附近土壤淋灌,每株200 mL,春、夏各1次,連續(xù)3 a,可效治療白紋羽病,且優(yōu)于甲基托布津,而甲基托布津治療效果與500 倍生防制劑相當(dāng)(表5)。
表4 B2 預(yù)防效果(1 a 生未發(fā)病雜交竹林地)Table 4 Prevent effect of B2 (one year old non-diseased hybrid bamboo)
表5 B2 治療效果(處理3 a 后發(fā)病雜交竹林地)Table 5 Control effect of B2 (diseased hybrid bamboo after treated for 3 years)
眾多研究表明,細(xì)菌有著其他微生物所不具備的優(yōu)點(diǎn),如種類和數(shù)量龐大,繁殖快速,作用方式多等等,以致在植物病害生物防治中有著非常重要的地位。目前,有18個(gè)屬的細(xì)菌在植物病害生物防治上有潛力[15],特別是芽孢桿菌屬的細(xì)菌,由于其抗逆性強(qiáng)、商貯性好,更是受到生防工作者重視。本文所分離的蠟樣芽孢桿菌,對(duì)雜交竹白紋羽病菌拮抗作用強(qiáng),能抗高溫、干燥,易繁殖,是一種有較高開發(fā)價(jià)值的生防菌。
植物根標(biāo)存在大量的有益微生物,現(xiàn)已從多種植物根際分離到對(duì)植物病害具有良好抑制效果的微生物[16~19],因此利用微生物防治撐×綠雜交竹白紋羽病可成為一種新途徑,本文從雜交竹根際獲得的芽孢桿菌,能很快定殖、占領(lǐng)土壤空間,排擠病原物,其防效持續(xù)、穩(wěn)定,優(yōu)于化學(xué)農(nóng)藥(甲基托布津)的效果。
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