楊曉蓉，陳炙，劉均利，郭洪英

(四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081)

金合歡(Acacia farnesiana (L.)Willd)，俗稱銀荊，屬含羞草科，合歡屬，原產(chǎn)澳大利亞，是優(yōu)良的觀賞與經(jīng)濟(jì)樹種［1］，主要分布在全世界的熱帶和亞熱帶地區(qū)。在我國云南、貴州、四川、廣西和浙江等地都有引種栽培，長勢均較好?；ǚ曳?，可提煉芳香油作高級香水等化妝品的原料。果莢、樹皮和根內(nèi)含有單寧，可做黑色染料。樹脂含有樹膠，可供藥用。木材堅(jiān)硬，可制貴重器具用品［2］。現(xiàn)階段金合歡繁殖主要依靠國外進(jìn)口種子，種子資源有限，價格昂貴，播種繁殖要求條件嚴(yán)格;因單寧含量較高，扦插生根困難［3］，因此用快速無性繁殖的生物技術(shù)能在短期內(nèi)繁殖出大量優(yōu)良苗木。本文主要研究金合歡的快繁技術(shù)。篩選出最佳配方及培養(yǎng)程序，為大量繁殖金合歡解決種子缺乏問題提供理論基礎(chǔ)，早日在生產(chǎn)上充分發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料選取田間2 a 生，長勢優(yōu)良的金合歡植株，取有側(cè)芽和頂梢的枝條。在4月至6月3次取樣，每次做9個處理樣，一個樣取40個側(cè)芽或頂梢進(jìn)行誘導(dǎo)。

1.2 操作方法

1.2.1 外植體誘導(dǎo)

將采回的枝條用剪刀修剪成1 cm～2 cm 長的小段，每段至少有一個側(cè)芽或頂梢。在流水下沖洗4h 以上。然后拿到接種室放在超凈工作臺上用70%酒精消毒10 s，再用0.1%升汞溶液浸泡8 min，并不停的搖動，再用無菌水沖洗4 遍～5 遍，最后接種在無菌的初代培養(yǎng)基上，為了避免材料因不可預(yù)見的原因而引起交叉感染，因此每一瓶最好接種一塊材料。每處理接種40個外植體，重復(fù)3次。放置在25℃恒溫的光照培養(yǎng)室里，啟動培養(yǎng)在光照強(qiáng)度1 000 lx～1 500 lx，光照時間12 h·d－1條件下進(jìn)行培養(yǎng)。1 周后基部組織開始膨大，3 周后芽開始萌發(fā)。5 周后統(tǒng)計(jì)外植體的發(fā)芽率。

1.2.2 繼代培養(yǎng)

待芽伸長1 cm 以上時，將無菌苗從莖段上切下來接種于增殖培養(yǎng)基中，15 d 以后一個個芽長成枝葉茂盛的小苗。每瓶10株(段)，直到把有效芽苗用完，20 d 后統(tǒng)計(jì)計(jì)算增殖系數(shù)。

1.2.3 生根培養(yǎng)

將繼代培養(yǎng)得到的健壯苗轉(zhuǎn)栽在生根培養(yǎng)基中。10 d 后小苗基部膨大逐步發(fā)出根來，待根長到1 cm 左右時就可煉苗，每處理30 瓶，每瓶20株小苗。20 d 后統(tǒng)計(jì)生根情況。將生根瓶苗拿在自然光下擺放一周再將苗上的培養(yǎng)基洗干凈栽入消毒后的土壤中，其成活率達(dá)到95%以上。

1.2.4 培養(yǎng)基的配制

整個培養(yǎng)過程主要采用不同濃度的MS 培養(yǎng)基，其中加入不同種類和濃度的細(xì)胞分裂素和生長素。在初培養(yǎng)階段降低培養(yǎng)基大量元素的用量，以減少愈傷組織分化，促進(jìn)芽分化，因此誘導(dǎo)培養(yǎng)采用3/4MS 的培養(yǎng)基。在增殖培養(yǎng)中加入40 mg·L－1的NaH2PO4以增加芽苗的發(fā)枝率。在做生根培養(yǎng)時，采用了1/2MS 無機(jī)鹽濃度減半的處理，由于金合歡含丹寧物質(zhì)較高，故加入0.2%～0.5%的活性炭以防止植株褐變，同時使培養(yǎng)基顏色變暗促進(jìn)根系萌發(fā)。培養(yǎng)基中加入1%～2%的蔗糖作為碳源，同時pH 調(diào)至6.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)

將外植體經(jīng)無菌處理后帶子葉的頂芽及側(cè)芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，15 d 后有的基部開始膨大，20 d后側(cè)部開始冒白色的小原點(diǎn)，30 d 后見多數(shù)莖節(jié)基部有側(cè)芽長出，再10 d 以后大多數(shù)瓶內(nèi)發(fā)的芽已長成1 cm 高，然后對各培養(yǎng)基配方中的發(fā)芽情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，結(jié)果見表1。

表1 不同激素濃度對外植體初代誘導(dǎo)的影響

從表1可以看出，細(xì)胞分裂素6－BA 對側(cè)芽的形成影響較為顯著，6－BA 濃度在0.5 mg·L－1時，形成的側(cè)芽很嫩、少、色淺。而當(dāng)6－BA 濃度在1.0 mg·L－1時，誘導(dǎo)產(chǎn)生的側(cè)芽淡綠色、長勢較好。當(dāng)6－BA 濃度在1.5 mg·L－1時出芽數(shù)較高，但生長狀態(tài)不夠好。生長素IBA 的濃度對芽生長影響極顯著，在生長素濃度較高的培養(yǎng)基上，開始芽點(diǎn)形成較好，分化的芽數(shù)較整齊，到后期芽長勢緩慢，葉片卷曲。生長素IBA 的濃度越高，形成的愈傷組織越多，會影響幼芽的生長。經(jīng)試驗(yàn)觀察IBA 的濃度在0.5 mg·L－1時側(cè)芽長勢較高，葉色正常。處理號6表現(xiàn)較好，分化率高、葉色正常，因此得出結(jié)論3/4 MS+6－BA 1.0 mg·L－1+IBA 0.5 mg·L－1是適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2.2 繼代培養(yǎng)

待誘導(dǎo)成活的芽苗長到2 cm 左右時接種到繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如表2 所示。當(dāng)6－BA 濃度較高時，芽苗長勢較矮，葉片小而卷曲，多為畸形，但增殖系數(shù)較高。當(dāng)6－BA 濃度較低時，增殖系數(shù)較低，芽苗高生長比較明顯，芽苗呈現(xiàn)較細(xì)嫩的狀態(tài)，不夠健壯。綜合考慮，取6－BA 1.0 mg·L－1為好。

表2 不同濃度激素組合對金合歡增殖的影響

同時，生長素NAA 作用顯著，與6－BA 的配合使用苗生長較佳，極大地促進(jìn)了外植體的生長分化，在0.3 至0.6 水平上各處理差異顯著。當(dāng)NAA 濃度過高時:植株生長較快，易徒長，表面看長勢好，可接種時葉子一碰全掉，芽苗的莖段也很脆，突顯一種細(xì)嫩徒長的狀態(tài)。NAA 濃度過低時，增殖系數(shù)受到一定影響，苗細(xì)、卷曲、不夠健壯。所以在篩選最佳激素組合時，植株的生長狀況需與芽苗的增殖系數(shù)綜合考慮才能選出最適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比。因此，金合歡繼代培養(yǎng)的最佳激素組合培養(yǎng)基是處理7，即:3/4MS +6－BA 1.0 mg·L－1+NAA 0.4 mg·L－1。

2.3 生根培養(yǎng)

以1/2MS 為基本培養(yǎng)基，加入不同激素配比做生根培養(yǎng)基篩選，待繼代培養(yǎng)的瓶苗長到1.5 cm 后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，20 d 后小苗長勢趨于穩(wěn)定時統(tǒng)計(jì)其生根率:生根率=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)100%。由表3 處理1 號、2 號可看出10 d 后基部有白色根點(diǎn)冒出，但發(fā)根不整齊;處理3 號、4 號、5 號10 d 后基部膨大，根點(diǎn)全部冒出。15 d 后可見表3 中5個處理號的根都增長。當(dāng)IBA 和NAA 激素濃度偏低時，所有的生根率明顯下降。由處理3 號、4 號、5 號可看出，當(dāng)IBA 濃度大于0.8 mg·L－1時，隨濃度增加生根率有所下降，可能是由于根部愈傷組織增多，阻礙了根的發(fā)育。當(dāng)NAA 濃度大于0.3 mg·L－1時，根系較長但易斷。由表3 的結(jié)果，有利于金合歡生根的激素配方是處理3 即:IBA 為0.8 mg·L－1，NAA 為0.3 mg·L－1。

表3 不同濃度的激素對瓶苗生根的影響

3 結(jié)論與討論

植物生長調(diào)節(jié)劑不同濃度配比顯著影響外植體生長。本試驗(yàn)對金合歡外植體誘導(dǎo)、幼苗增殖及生根培養(yǎng)進(jìn)行了研究，認(rèn)為金合歡初代培養(yǎng)以3/4MS+6－BA1.0 mg·L－1+IBA 0.5 mg·L－1效果較好，能較快的啟動外植體生長。繼代培養(yǎng)階段以MS+ 6－ BA1.0 mg · L－1+NAA0.4 mg · L－1+NaH2PO440 mg·L－1為宜，增殖系數(shù)可達(dá)3.83，使之成為健壯的植株。而促進(jìn)金合歡生根的培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.8 mg·L－1+NAA0.3 mg·L－1，生根率可達(dá)到80%以上。誘導(dǎo)生根長到1 cm 左右時，可將生根瓶苗放置在自然光下擺放1 周進(jìn)行煉苗，再將苗上的培養(yǎng)基洗凈栽入滅菌后的土壤中，其成活率達(dá)到95%以上。

植物生長調(diào)節(jié)劑是影響培養(yǎng)物形態(tài)建成的主要因子［4］?；九囵B(yǎng)基只能保證培養(yǎng)物的生成與最低生理活動，只有配合使用適當(dāng)?shù)闹参锷L調(diào)節(jié)劑才能啟動細(xì)胞分裂、愈傷組織生成及啟動根、芽的分化。由于各種植物的遺傳特性不一致，其對培養(yǎng)基要求也不一致，因此選擇適宜的培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑的具體配比對植物組織培養(yǎng)至關(guān)重要，本文試驗(yàn)以陳正華等文獻(xiàn)［5］為依據(jù)，選擇在MS 基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)省進(jìn)行調(diào)整:3/4MS，1/2MS，將MS 培養(yǎng)基元素中的KNO3、NH3NO4均減1/4 或1/2，其余成分保持不變。在本實(shí)驗(yàn)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果表明較低濃度的6－BA 適宜芽分化。IBA 作用顯著，與6－BA的配合使用極大促進(jìn)了外植體的生長分化，因此繼代培養(yǎng)任選用了較低濃度的6－BA 和NAA，以抑制愈傷組織生長，促進(jìn)叢芽發(fā)育，并保持芽苗分化旺盛。同時實(shí)驗(yàn)證明，在生根培養(yǎng)中較低濃度的IBA和NAA是適宜的。

在本研究中，金合歡增殖系數(shù)和生根率還不夠理想，離大規(guī)模生產(chǎn)還有一定距離，如何在本研究基礎(chǔ)上調(diào)整培養(yǎng)基配方以提高增殖系數(shù)及生根質(zhì)量尚需進(jìn)一步研究。

［1］翟建中.金合歡組織培養(yǎng)和快速繁殖的研究［J］.園藝學(xué)報(bào)，2001，28(2):149～152.

［2］譚文澄，戴策剛.觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)［M］.北京:中國林業(yè)出版社，1997，63.

［3］陳桂芳，婁利華.銀荊相思組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)研究［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26(2):195～197.

［4］黃學(xué)林，李筱菊.高等植物立體培養(yǎng)的形態(tài)建成及其調(diào)控［M］.北京:科學(xué)出版社，1995，47.

［5］陳正華.木本植物組織培養(yǎng)及其應(yīng)用［M］.北京:高等教育出版社，1986，41.