馬景蕃，黃素華，劉喜明，黎 英，周酵瓊

（1.龍巖學院生命科學學院，福建 龍巖 364012；2.龍巖學院資源工程學院，福建 龍巖 364012）

蛋白激酶催化的蛋白磷酸化和蛋白磷酸酶催化的去磷酸化作用在植物細胞感受各種環(huán)境信號及其信號轉(zhuǎn)導與放大過程中起重要作用[1]，其中促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen－activated protein kinases，MAPKs）的作用受到廣泛關注。近年來，研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)MAPK參與激素應答、環(huán)境脅迫反應以及植物抗病反應[2]。在植物抗病反應調(diào)控方面，發(fā)現(xiàn)MAPK可以參與抗病基因介導的抗病反應、過敏性反應中細胞死亡以及植物的先天性免疫反應等[3]。例如在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，使用MPK4特異性抗體進行生物化學分析發(fā)現(xiàn)，各種各樣的生物和非生物脅迫都能夠誘導MPK4激活[4]。

植物防御與病原菌侵染是一個互動過程，在此過程中植物針對病原菌不同的侵染方式會做出相應特異的防衛(wèi)反應[5]。研究表明水楊酸（Salicylic acid，SA）、茉莉酸（Jasmonic acid，JA）和脫落酸（Abscisic acid，ABA）等植物激素也參與植物抗病、抗逆過程[6]，其中SA和JA是植物防衛(wèi)信號轉(zhuǎn)導途徑中關鍵的信號分子。由水楊酸和茉莉酸介導的防衛(wèi)反應是植物抵御病原菌的最重要方式。很多研究表明這兩種防衛(wèi)反應方式存在明顯交叉和拮抗，一些植物主要通過茉莉酸介導的防衛(wèi)反應方式抵抗對非專性寄生性病原菌的侵染[7]。擬南芥MPK4是水楊酸和茉莉酸介導的防衛(wèi)反應調(diào)節(jié)基因，其功能缺失突變體表現(xiàn)出對壞死型病原菌高度敏感，表明該基因在抗壞死型病原菌中起作用[8]，但至今為止，還沒有關于這些病害防御信號分子與不結(jié)球白菜MPK4基因表達之間關系的報道。

不結(jié)球白菜（Brassica campestrisssp.chinensisMakino）原產(chǎn)于中國，其營養(yǎng)豐富，是長江中下游地區(qū)主要蔬菜品種之一，但不結(jié)球白菜病害相當嚴重，其中菌核病[Sclerotinia sclerotiorumde（Bary）]是最主要病害之一，常給菜農(nóng)造成極大經(jīng)濟損失[9]。不結(jié)球白菜菌核病屬非專性寄生[10]，能產(chǎn)生壞死斑，而草酸是菌核病主要的致病因子。

本研究將采用實時熒光定量PCR法研究不結(jié)球白菜BcMPK4在核盤菌接種、核盤菌致病因子草酸處理、病害防衛(wèi)反應信號分子SA、JA類似物MeJA和植物激素ABA處理后的表達變化差異，期望了解菌核病及其致病因子草酸、防衛(wèi)反應信號分子、植物激素ABA與BcMPK4表達的關系，為不結(jié)球白菜抗菌核病的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為不結(jié)球白菜抗菌核病品種003－R－6和高感品種003－S－7，由龍巖學院生物技術課題組提供。將兩個品種的種子用0.1%HgCl2浸泡5 min，然后用蒸餾水沖洗干凈，置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于25℃催芽24 h。然后將催芽后的種子播種于滅菌基質(zhì)中，于人工培養(yǎng)箱在白天25℃、夜晚15℃、12 h/12 h光周期條件下培養(yǎng)，待幼苗培育至四葉一心時用于試驗。

1.2 方法

1.2.1 菌核病的接種

核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）菌核采自龍巖學院生命科學學院試驗田內(nèi)的不結(jié)球白菜莖稈。選好菌核后，用75%乙醇浸泡30 s，0.1%HgCl2消毒10 min，再用無菌水沖洗4次，把滅菌菌核切去兩端，中間部分切成綠豆大小，切面朝下，接種于PDA（Potato dextrose agar）培養(yǎng)基。在25℃下暗培養(yǎng)4 d，待菌絲長滿培養(yǎng)皿后，用打孔器將菌絲截成直徑為0.4 cm大小的菌絲瓊脂塊，用于接種。待幼苗長至四葉一心時對第三葉進行菌核病菌接種處理，接種前5 d將植株22℃恒溫培養(yǎng)，選用核盤菌的菌絲塊進行活體接種，對照接種無菌培養(yǎng)基塊。每個處理設3次重復。

1.2.2 化學誘導處理

草酸（Oxalic acid，OA），分析純，購自同濟大學生物技術開發(fā)公司；水楊酸、甲基茉莉酸（Methyl jasmonate，MeJA）和脫落酸購自Sigma公司。

當不結(jié)球白菜幼苗長至四葉一心時進行誘導處理，處理前5 d將植株進行22℃恒溫培養(yǎng)。分別用5 mmol·L－1草酸（OA）、0.1 mmol·L－1水楊酸（SA）[11]、0.1 mmol·L－1甲基茉莉酸（MeJA）、0.1 mmol·L－1脫落酸（ABA）[12]噴霧四葉期植株的第三片真葉，滅菌雙蒸水噴霧處理相同苗齡的相應葉片為對照。噴霧至葉片上均勻布滿液滴為止。每種處理20株，3次重復。將各種不同處理的植株分別放入不同的密封間，22℃恒溫保濕培養(yǎng)。

1.2.3 取樣

上述核盤菌及不同化學試劑處理不結(jié)球白菜抗感品種后，分別在0、4、8、16、24、48、72 h剪下處理葉片（包括對照葉片），用錫箔紙包裹，迅速置于液氮中，8 min后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存。

1.2.4 總RNA提取及cDNA第1鏈的合成

不結(jié)球白菜葉片總RNA提取參考Ma等方法進行[13]，所用玻璃和塑料制品均經(jīng)0.1%DEPC浸泡過夜，高溫高壓滅菌處理。利用TaKaRa公司寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Primescript 1st strand cDNA synthesis kit）合成第一鏈cDNA。

1.2.5 實時定量PCR檢測

實時定量PCR方法參照SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒（TaKaRa），以不結(jié)球白菜3－磷酸甘油醛脫氫酶基因（BcGAPDH，DDBJ登錄號AB331373）作為內(nèi)標基因，引物為：5'CTGTCT CGCTCCATTCG 3'和5'AGTTTCCCTTTGAGGTTAG 3'，BcMPK4基因引物序列為：5'GACACTGATC TCCACCAG 3'和 5'ATCCTATAAGCTCAGTGAT 3'。引物由金思特生物技術有限公司合成。反應在Rotor Gene 3000（Corberr Research公司）熒光梯度PCR儀上進行擴增，總體系為25 μL，熱啟動程序為95℃預變性2 min；95℃變性20 s，52℃退火20 s，72℃延伸20 s，共45個循環(huán)；熔解曲線測定為從60℃到95℃，3次重復。數(shù)據(jù)由Opticon Monitor TM 1.02（MJ公司）軟件和Excel軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核盤菌侵染后BcMPK4分別在抗、感病品種中表達的變化

圖1 實時定量PCR檢測不結(jié)球白菜經(jīng)核盤菌誘導后BcMPK4基因的表達Fig.1 qPCR analysis of relative expression levels of BcMPK4 induced by Sclerotinia sclerotiorum

擬南芥MPK4功能缺失突變體對非專化寄生性病原菌Alternaria brassicicola表現(xiàn)出增加感病性表型，并且伴隨防衛(wèi)素基因的表達降低[8]。為檢測不結(jié)球白菜BcMPK4基因是否在防衛(wèi)非?；纳圆≡鶶clerotinia sclerotiorum的侵染中行使功能，采用實時熒光定量PCR檢測BcMPK4在不結(jié)球白菜抗感品種中被核盤菌侵染后的表達變化。結(jié)果顯示，在抗性品種003－R－6中，當核盤菌侵染4 h時，BcMPK4表達量迅速上升，與對照相比差異顯著（P＜0.05）。當侵染8 h時，BcMPK4表達量上升至最高，約是對照的1.8倍，與對照相比差異達極顯著水平（P＜0.01）。之后BcMPK4表達量開始下降，當侵染24和48 h時，BcMPK4表達量顯著低于對照，當侵染72 h時，BcMPK4表達量再次升高，與對照相比差異極顯著（P＜0.01）。而感病品種003－S－7接種核盤菌后，BcMPK4表達量與抗病品種迥然不同，感病品種均表現(xiàn)為下調(diào)表達，而且隨著侵染時間的延長，BcMPK4表達量逐漸下降，當侵染72 h時，BcMPK4表達量達最低，約為對照的0.22倍（見圖1）。

2.2 草酸誘導BcMPK4在抗、感病品種中表達的動態(tài)變化

草酸是一種包括核盤菌在內(nèi)的許多病原真菌分泌的植物毒素。為研究草酸與BcMPK4之間的關系，選用5 mmol·L－1草酸來處理不結(jié)球白菜抗感品種葉片，觀察這個基因在不同抗感品種中不同處理時間點的表達變化。結(jié)果顯示，在品種003－R－6中，經(jīng)草酸誘導4 h時，BcMPK4表達量迅速上升，與對照相比差異顯著（P＜0.05）。當誘導8 h時，BcMPK4表達量上升至最高，約是對照的1.7倍，與對照相比差異達極顯著水平（P＜0.01）。當誘導24、48和72 h時表達量均下調(diào)，大約分別是對照的82%、67%和43%，與各自對照相比差異均達顯著水平（P＜0.05）。而感病品種003－S－7經(jīng)草酸誘導后，BcMPK4表達量均表現(xiàn)為下調(diào)表達，而且隨著誘導時間的延長，其表達量逐漸下降，當侵染72 h時，BcMPK4表達量達到最低，約為對照的16%（見圖2）。

圖2 實時定量PCR檢測不結(jié)球白菜經(jīng)草酸誘導后BcMPK4基因的表達Fig.2 qPCR analysis of relative expression levels of BcMPK4 induced by oxalic acid

2.3 水楊酸誘導BcMPK4在抗、感病品種中表達的動態(tài)變化

經(jīng)水楊酸誘導后，在品種003－R－6中，BcMPK4表達總體呈現(xiàn)先升后降趨勢（見圖3）。誘導4 h時，BcMPK4表達量迅速上升，與對照相比差異顯著（P＜0.05）。當誘導8 h時，BcMPK4表達量上升至最高，約是對照的1.8倍，與對照相比差異達極顯著水平（P＜0.01）。誘導16 h時，表達量開始下降，誘導24 h時，表達量下降到對照的76%，到72 h下降至21%。表明在不結(jié)球白菜抗性品種中水楊酸可快速誘導MPK4上調(diào)表達。感病品種003－S－7經(jīng)水楊酸誘導后，BcMPK4表達量均表現(xiàn)為下調(diào)表達，隨著誘導時間的延長，其表達量逐漸下降，當侵染72 h時，BcMPK4表達量達到最低，約為對照的27%（見圖3）。

2.4 甲基茉莉酸誘導BcMPK4在抗、感病品種中表達的動態(tài)變化

圖3 實時定量PCR檢測不結(jié)球白菜經(jīng)水楊酸誘導后BcMPK4基因的表達Fig.3 qPCR analysis of relative expression levels of BcMPK4 induced by salicylic acid

茉莉酸是植物防御反應信號轉(zhuǎn)導途徑中重要的信號分子，而甲基茉莉酸（MeJA)是其功能類似物。采用信號分子茉莉酸的類似功能處理不結(jié)球白菜葉片，通過研究在不同處理時間點BcMPK4在不結(jié)球白菜體內(nèi)表達差異來探討該基因與茉莉酸的關系。如圖4所示，不結(jié)球白菜抗感兩個品種經(jīng)MeJA處理后，BcMPK4表達都被抑制，抗性品種于處理后4 hBcMPK4相對表達量約為對照的50%，但處理后8 h，其表達量逐漸上升，于處理后72 h表達量達最大，約為對照的84%?？梢娞幚? h后，MeJA對不結(jié)球白菜BcMPK4表達抑制率逐漸下降。感病品種經(jīng)MeJA處理后4 h，BcMPK4相對表達量約為對照的27%，與抗性品種相比，抑制幅度更大。處理后8 h，其表達量逐漸上升，但與抗性品種相比，上升幅度更?。ㄒ妶D4）。

2.5 ABA誘導BcMPK4在抗、感病品種中表達的動態(tài)變化

ABA等植物激素也參與植物抗病、抗逆過程[14]。經(jīng)ABA處理后，BcMPK4表達水平變化在抗感品種中各不相同，在抗性品種中，ABA處理對BcMPK4表達影響不大，在整個研究時間范圍內(nèi)，處理與對照的差異均未達顯著水平（P＜0.05）。而在感性品種中，于處理后4 h，表達量開始逐漸下降，經(jīng)處理后72 h，BcMPK4表達量達最低，約為對照的47%，表達差異達極顯著水平（P＜0.01）（見圖5）。

圖4 實時定量PCR檢測不結(jié)球白菜經(jīng)甲基茉莉酸誘導后BcMPK4基因的表達Fig.4 qPCR analysis of relative expression levels of BcMPK4 induced by methyl jasmonate

圖5 實時定量PCR檢測不結(jié)球白菜經(jīng)脫落酸誘導后BcMPK4基因的表達Fig.5 qPCR analysis of relative expression levels of BcMPK4 induced by abscisic acid

3 討論

SIPK和WIPK是在煙草中發(fā)現(xiàn)的MAP激酶，其生物學功能說明MAPK鏈參與抗性基因介導的信號傳遞，即含有抗TMV的抗性基因—N基因的煙草植株，在與無毒菌株互作時，通過Ser/Thr和Tyr氨基酸位點的磷酸化可激活WIPK蛋白發(fā)揮作用。雖然很多抗性基因介導的防衛(wèi)反應大多依賴SA存在，但WIPK的激活卻不依賴SA[15]，說明這個蛋白在“基因?qū)颉保╣ene－for－gene）介導的抗病反應中起作用。此外，Romeis等用來自病原菌無毒基因Avr9處理含有抗性基因Cf29的煙草懸浮細胞，發(fā)現(xiàn)Cf29/Avr9的互作激活SIPK和WIPK兩種蛋白，推測MAP激酶可能位于抗性基因介導的信號傳遞鏈下游[3]。目前已知SA以及非特異激發(fā)子等都能激活SIPK和WIPK蛋白，說明它們誘導的多個抗性基因信號途徑是通過SIPK或WIPK等MAPK鏈發(fā)揮作用。

本試驗研究結(jié)果顯示，核盤菌侵染初期，不結(jié)球白菜抗性品種BcMPK4表達量迅速上升，而感性品種該基因表達量逐漸下降（見圖1），表明BcMPK4參與不結(jié)球白菜對核盤菌抗性反應。草酸能夠誘導BcMPK4在不結(jié)球白菜抗性品種中表達，表現(xiàn)在經(jīng)草酸誘導初期BcMPK4在抗性品種中表達迅速上升（見圖2），由圖1和2可以看出，草酸與核盤菌誘導BcMPK4基因的表達在0～48 h內(nèi)是一致的，這個結(jié)果支持核盤菌在侵染植物時釋放草酸毒素是其重要致病機理。同時也說明植物通過增加BcMPK4表達抵御侵染脅迫。但是與草酸不同，核盤菌是活性生物，可以持續(xù)對植物細胞進行侵染破壞，所以經(jīng)核盤菌處理后，在抗性品種中BcMPK4表達出現(xiàn)兩次高峰（見圖1），這種表達動態(tài)可能暗示植物與核盤菌之間存在動態(tài)相互作用。經(jīng)草酸和SA誘導后，BcMPK4表達在抗感品種中的變化趨勢是高度一致的。另外，在0～48 h，草酸、SA、核盤菌誘導BcMPK4表達反應趨勢也一致。這說明不結(jié)球白菜對SA、草酸以及核盤菌反應機制的分子網(wǎng)絡中包含BcMPK4。

MeJA和SA誘導BcMPK4在抗性品種中的表達趨勢截然不同，特別是在誘導4 h的初期反應中，SA和MeJA分別誘導BcMPK4上調(diào)和下調(diào)表達（見圖3、4）。因此BcMPK4在不結(jié)球白菜中可能調(diào)節(jié)SA介導的防衛(wèi)反應。這與擬南芥中AtMPK4的研究結(jié)果是一致的[4]。經(jīng)ABA處理后BcMPK4表達水平在抗性品種中幾乎無變化（見圖5），說明ABA不能介導BcMPK4在不結(jié)球白菜中的防衛(wèi)反應。

4 結(jié)論

本研究采用實時熒光定量PCR法研究不結(jié)球白菜BcMPK4在菌核病防衛(wèi)反應中的作用。結(jié)果表明，核盤菌、OA和SA能快速誘導BcMPK4在抗性品種中表達，而MeJA抑制其表達，ABA對BcMPK4表達響應不明顯，由此推測BcMPK4在核盤菌誘抗信號轉(zhuǎn)導和SA信號通路中起關鍵作用。

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