劉學光,鄭懷東,郭欣碩,羅靳,藺翠翠,王秋雨

(1.遼寧省水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測局,遼寧沈陽110031;2.遼寧大學生命科學院,遼寧沈陽110036)

傳染性造血器官壞死病毒糖蛋白的原核表達及多克隆抗體的制備

劉學光1,鄭懷東1,郭欣碩1,羅靳1,藺翠翠1,王秋雨2

(1.遼寧省水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測局,遼寧沈陽110031;2.遼寧大學生命科學院,遼寧沈陽110036)

通過人工合成方法得到傳染性造血器官壞死病毒 (IHNV)糖蛋白 (G蛋白)基因,將該基因克隆到表達載體pET-30a,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-30a/IHNV-G,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)plySs中。經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western blotting分析表明,在1 mmol/L IPTG(誘導劑)、37℃條件下誘導4 h后,G蛋白在大腸桿菌中成功表達,得到了相對分子質(zhì)量約為57 000的G蛋白。采用直接切膠免疫小鼠的方法制備多克隆抗體,ELISA分析結(jié)果顯示,血清效價可達到1∶10 000。本試驗中得到的G蛋白和多抗血清可為IHNV疫苗的研制以及膠體金試紙條快速檢測方法的建立提供理論基礎(chǔ)。

病毒;原核表達;包涵體;G蛋白;抗體

傳染性造血器官壞死病病毒 (Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)被歸類為諾拉彈狀病毒屬 Novirhabdovirus[1],屬于負股 RNA 病毒[2-3]。IHNV囊膜表面有一個糖蛋白突起,即糖蛋白,又稱為囊膜蛋白 (簡稱G蛋白)。在細胞受體與病毒的識別和結(jié)合等過程中,IHNV的G蛋白起著非常重要的作用,并直接關(guān)系到病毒的毒力。G蛋白還是病毒的主要抗原,可以誘導產(chǎn)生特異性免疫中和抗體,刺激細胞免疫[4-5]。因此,G蛋白是IHNV中非常重要的結(jié)構(gòu)蛋白,對其進行基礎(chǔ)性研究具有重要意義。

由IHNV引發(fā)的傳染性造血器官壞死病 (Infectious hematopoietic necrosis,IHN)主要的感染宿主為鮭科魚類,據(jù)研究表明,它能使受感染魚苗(含幼魚)的死亡率達到70%～90%。IHNV對世界范圍內(nèi)的鮭魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[6]。20世紀90年代,中國第一例IHN在遼寧省本溪的某養(yǎng)殖場被報道[7]。IHN被中國列為二類疫病,是口岸魚類的第一類檢疫對象。目前,國內(nèi)外對IHN病的研究尚不成熟,還處在基礎(chǔ)性研究階段。IHNV病毒的檢測技術(shù)主要有兩類:一類是免疫學技術(shù),如免疫熒光技術(shù)[8]、中和試驗[9]、酶聯(lián)免疫吸附試驗[10-11]等;另一類是分子生物技術(shù),如核酸雜交技術(shù)[12]和核酸擴增技術(shù) (PCR、Real-time RT-PCR和等溫擴增技術(shù))等[13-15]。免疫學檢測方法操作較繁瑣,試驗周期長;熒光定量PCR技術(shù)具有高特異性、高靈敏性、線性范圍寬、操作簡單等特點[16],但有其局限性,如樣品的前處理復雜、分析耗時且需要特殊的儀器設備,從而不易推廣。本研究中,作者從合成抗原入手,對G蛋白基因進行了原核表達,利用純化的IHNV-G免疫小鼠制備多克隆抗體,以期為膠體金試紙條快速檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

克隆載體pMD18-T Simple、大腸桿菌宿主菌Escherichia coli JM109購自寶生物工程 (大連)有限公司;表達載體pET-30a由遼寧大學生命科學院細胞生物學實驗室保存;大腸桿菌BL21(DE3) plySs感受態(tài)細胞購自天根生化科技 (北京)有限公司。Taq DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶 (KpnI和SalI)、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;弗氏完全佐劑(Freund's com-plete adjuvant,FCA)購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆及pET-30a/IHNV-G表達載體的構(gòu)建 通過GeneBank檢索IHNV-G蛋白基因序列,經(jīng)優(yōu)化后添加KpnI和SalI酶切位點、His標簽,確定總長為1 545 bp的IHNV-G蛋白基因序列,并由寶生物工程 (大連)有限公司合成。將該基因連接到pMD18-T Simple載體,轉(zhuǎn)化至E.coli JM109中,經(jīng)PCR擴增,檢測質(zhì)粒中插入片段的長度,選取陽性克隆的菌落進行保存。

分別用KpnI和SalI將IHNV-G蛋白基因和pET-30a載體進行雙酶切,酶切后用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物?；厥蘸蟮幕蚱魏突厥蘸蟮膒ET-30a載體片段用T4DNA連接酶連接過夜,構(gòu)建成pET-30a/IHNV-G重組表達質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)plySs感受態(tài)細胞中,用氨芐青霉素抗性篩選,挑單菌落進行培養(yǎng)。用PCR方法篩選陽性克隆,用雙酶切法鑒定是否重組成功,將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送TaKaRa公司測序。

1.2.2 G蛋白的誘導表達及鑒定 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)plySs感受態(tài)細胞中,挑取單個菌落接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,次日以1∶10的比例接種于LB培養(yǎng)基中,于37℃下振蕩培養(yǎng)3 h,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG(誘導劑)進行誘導表達,同時做陰性對照 (不加IPTG),表達時間分別為1、2、3、4、5 h。誘導后終止培養(yǎng),離心收集菌體,用超聲波破碎,于100℃下變性5 min,分別上樣進行SDS-PAGE電泳分析,用考馬斯亮藍R-250染色并觀察。

1.2.3 G蛋白的Western blotting分析 將G蛋白用1 mmol/L IPTG誘導4 h后,超聲破碎菌液,常規(guī)制樣后取10 μL上樣至SDS-PAGE(12%分離膠)進行電泳,按照常規(guī)方法進行轉(zhuǎn)膜。為了檢測蛋白是否電轉(zhuǎn)成功,采用麗春紅染色,然后用蒸餾水洗滌數(shù)次至無色為止,用5 g/L脫脂牛奶在室溫封閉2 h,加入抗His標簽單克隆抗體,室溫下結(jié)合1 h,4℃下孵育過夜,用TBST洗膜3次 (10 min/次),加入辣根過氧化物酶 (HRP)標記的羊抗鼠IgG抗體結(jié)合1 h,再用TBST洗膜3次 (10 min/次),用化學發(fā)光法顯色并觀察。

1.2.4 G蛋白包涵體的制備及純化 取重組菌于37℃下振蕩培養(yǎng)3 h,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,于37℃下誘導4 h。大量誘導表達的菌液經(jīng)1×PBS重懸離心后收獲菌體沉淀。加入超聲緩

沖液重懸菌體,在液氮中反復凍融后超聲破碎(400 W下工作5 s,間隔5 s),收集沉淀。用清洗緩沖液超聲清洗包涵體沉淀,然后溶解包涵體,離心后將上清稀釋至0.1～1.0 mg/mL,裝入透析袋并置于梯度復性緩沖液中,于4℃下緩慢透析24～36 h。再于純化緩沖液中透析后,進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 多克隆抗體的制備與鑒定 將包涵體洗滌后,經(jīng)SDS-PAGE分離目的蛋白,在KCl溶液中染色,2～3 min后出現(xiàn)乳白色的目的條帶,切下目的蛋白帶,用PBS緩沖液洗去殘留的KCl溶液,共洗滌2次,于-70℃下保存。初次免疫,將切下的蛋白凝膠磨碎,與弗氏完全佐劑按等體積比震蕩混勻,給每只小鼠背部皮下多點注射,對照組小鼠用滅菌的PBS緩沖液和弗氏佐劑等體積比混勻后進行注射,注射量與試驗組相同。3周后,第1次對小鼠加強免疫,將蛋白凝膠與弗氏不完全佐劑以等體積比混勻后給小鼠注射。每隔2周,使用上述方法進行第2次和第3次加強免疫。第3次加強免疫后1周,從小鼠尾部采血,將血液置于離心管中,在37℃下放置1 h,然后置于冰箱 (4℃)中過夜,待血清析出后提取血清。用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測效價:用純化后的蛋白包被酶聯(lián)反應板,稀釋抗血清,第一個孔以1∶2 500的比例稀釋,其余孔以1∶2的梯度倍比稀釋,同時做陰性對照。用辣根酶標記的羊抗鼠IgG作為二抗,TMB顯色,用酶標儀測定450 nm處的吸光值。

2 結(jié)果

2.1 pET-30a/IHNV-G表達載體的構(gòu)建

重組質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶KpnI和SalI酶切后得到的酶切片段見圖1,鑒定結(jié)果表明,目的基因插入到表達載體中并且其讀碼框正確,表明 pET-30a/ IHNV-G重組質(zhì)粒成功構(gòu)建。

2.2 G蛋白的誘導表達及SDS-PAGE分析

在IPTG濃度為1 mmol/L、溫度為37℃,誘導表達4 h的條件下,G蛋白的表達量趨于穩(wěn)定,在相對分子質(zhì)量約57 000處有明顯的表達條帶(圖2),與預計的理論值相符,表明目的基因得到了表達。超聲破碎細菌后,對上清液和沉淀進行SDS-PAGE(12%分離膠)電泳,可見目的蛋白在上清液中的表達量很少,而在沉淀中有大量表達(圖3),表明目的蛋白主要以包涵體的形式存在。

圖1 重組質(zhì)粒pET-30a/IHNV-G的酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET-30a/ IHNV-G by double-digestion

圖2 不同誘導時間下G蛋白的表達Fig.2 G protein expression induced by various periods

2.3 G蛋白的Western blotting分析

對G蛋白進行純化處理后,采用Western blotting方法進一步進行驗證。從圖4可見,未經(jīng)IPTG誘導的蛋白無條帶,經(jīng)IPTG誘導4 h后出現(xiàn)約57 000的特異性條帶。結(jié)果表明,重組菌在37℃下經(jīng)IPTG誘導4 h后,G蛋白在大腸桿菌中成功表達。

圖3 IHNV-G蛋白包涵體的電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis analysis of IHNV-G protein

圖4 G蛋白的Western blotting分析Fig.4 Analysis of G protein by Western blotting

2.4 G蛋白包涵體的制備及純化

G蛋白的表達產(chǎn)物基本上以包涵體形式存在于沉淀中。蛋白上樣量為10 μL時分析得到明顯蛋白條帶,相對分子質(zhì)量約為57 000(圖3)。

超聲清洗后分離沉淀,收集用尿素充分洗滌后的包涵體,經(jīng)梯度透析后,取純化的目的蛋白進行SDS-PAGE電泳分析 (圖5)。結(jié)果表明,目的條帶相比透析前亮度有所減弱,但雜帶明顯減少,起到了純化的目的。

圖5 純化后的G蛋白分析Fig.5 Analysis of G protein after purification

2.5 多克隆抗體的制備與鑒定

以純化的G蛋白包板,對制得的多克隆抗體血清稀釋后進行ELISA檢測。結(jié)果表明,多抗血清效價可達到1∶10 000(圖6)。

圖6 IHNV抗血清效價的ELISA測定Fig.6 ELISA dectection of anti-serum of IHNV

3 討論

IHNV的不同株系在核苷酸水平上具有較高的相似性,而在蛋白質(zhì)水平上相似性較低。IHNV-G蛋白是IHN非常重要的蛋白,在誘導產(chǎn)生抗體及免疫保護機制中起著重要的作用。據(jù)文獻報道,G蛋白基因可以誘導鮭鱒魚類產(chǎn)生約75%的免疫保護率[17]。因此,G蛋白是重要的靶蛋白,在疫苗研制和診斷方法研究中起著非常重要的作用。

本研究中對G蛋白基因的原核表達及免疫反應性進行了研究。在原核表達系統(tǒng)中,pET表達系統(tǒng)在試驗中經(jīng)常被使用,很多種類的異源蛋白在大腸桿菌中都能夠成功表達[18-21]。但是在大腸桿菌中表達的異源蛋白經(jīng)常發(fā)生錯誤的折疊,并聚集成為包涵體。為了更好地得到表達的蛋白,許多科研工作者通過降低誘導溫度,改變IPTG濃度及誘導時間等方法得到可溶性蛋白。本研究中對重組蛋白進行了可溶性分析,結(jié)果表明,重組蛋白的存在形式主要為包涵體,其內(nèi)的重組蛋白質(zhì)量分數(shù)普遍高于50%,其余的成分主要為內(nèi)毒素、外膜蛋白、質(zhì)粒DNA和多糖等[18]。

重組蛋白在表達的過程中,由于某些決定蛋白折疊的輔助因子缺乏,不能形成次級鍵,形成了包涵體,然而包涵體的形成是目的蛋白表達量很高的表現(xiàn)。作者認為,G蛋白基因在原核表達系統(tǒng)中成功表達的關(guān)鍵是有合適的受體菌,并且外源蛋白在細胞中以融合蛋白的形式存在。G蛋白包涵體的純化方法簡便 (采用破碎包涵體的方法純化目的蛋白),將其經(jīng)PBS懸浮和適當?shù)淖魟┤榛幚砗?就可以直接用于注射免疫,制備抗體。

本研究中合成并克隆了IHNV的G蛋白基因序列,總長為1 545 bp,包含IHNV-G的全長基因,編碼515個氨基酸。成功構(gòu)建了大腸桿菌重組表達系統(tǒng)pET-30a/IHNV-G,能夠在較短的時間內(nèi)獲得大量表達。得到了預期相對分子質(zhì)量約為57 000的目的蛋白。切膠免疫小鼠制備多克隆抗體,經(jīng)ELISA法檢驗,抗體效價達1∶10 000以上。重組蛋白具有純度高、易于得到、實用性強等優(yōu)點,本研究中采用重組G蛋白作為抗原來制備抗體,在一定程度上降低了病毒傳播的風險,但重組抗原在抗原決定簇上與天然蛋白相比可能存在差異。

綜上所述,IHNV-G蛋白及多克隆抗體的獲得為進一步研究G蛋白基因提供了有利的技術(shù)支持,也為膠體金試紙條快速檢測方法的研究和試劑盒的開發(fā)應用奠定了基礎(chǔ)。

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Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of glycoprotein gene in infectious hematopoietic necrosis virus

LIU Xue-guang1,ZHENG Huai-dong1,GUO Xin-shuo1,LUO Jin1,LIN Cui-cui1,WANG Qiu-yu2

(1.Bureau of Testing on Aquatic Products Quality Safety of Liaoning Province,Shenyang 110031,China;2.College of Life Sciences,Liaoning University,Shenyang 110036,China)

Glycoprotein gene(G)in infectious hematopoietic necrosis virus(IHNV-G)was gained in infectious hematopoietic tissue through a synthetic method.The full length sequence of IHNV-G gene was synthesized and cloned to prokaryotic expression system pET-30a vector.The plasmid pET-30a/IHNV-G was transformed into BL21(DE3)plySs in bacterium Escherichia coli.SDS-PAGE and Western blotting showed that the protein was expressed highly as inclusion body,fusion G protein with molecular weight of 57 000.The serum in rabbits four hours immunized with the fusion G protein was then used for ELISA analyses which showed that the serum had titer of 1∶10 000,indicating that the G protein and anti-serum could be used in research of IHNV detection method, vaccination and protein function.

IHNV;prokaryotic expression;inclusion body;G protein;antibody

S941.41

A

2013-05-01

遼寧省海洋與漁業(yè)廳項目 (2011014)

劉學光 (1973-),男,高級工程師。E-mail:lxueguang@163.com

2095-1388(2013)03-0254-05