鄭金娃,汪秋寬,何云海,劉舒,任丹丹

(大連海洋大學(xué)遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

海參多肽脫色脫腥工藝的優(yōu)化研究

鄭金娃,汪秋寬,何云海,劉舒,任丹丹

(大連海洋大學(xué)遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

以仿刺參Apostichopus japonicus為原料,經(jīng)復(fù)合酶解得海參多肽酶解液,通過(guò)靜態(tài)吸附試驗(yàn)及柱層析分離試驗(yàn)研究了粉末活性炭、顆?；钚蕴?、硅藻土、強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂 (D280)、弱堿性陰離子樹(shù)脂(D380)、弱酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂 (D301R、D315、D301T、D152)和大孔吸附樹(shù)脂 (D3520、ADS-5、ADS-7)對(duì)海參多肽酶解液的脫色脫腥效果,以優(yōu)化海參多肽脫色脫腥工藝。結(jié)果表明:樹(shù)脂D280的脫色脫腥效果最佳,最佳脫色脫腥工藝為酶解液與樹(shù)脂體積比為3∶1,流速為2 mL/min,在此脫色脫腥工藝條件下,脫色率達(dá)69.78%,游離氨基酸態(tài)氮回收率為86.42%,海參多肽回收率為82.49%,脫腥率達(dá)67%,海參多肽酶解液通過(guò)D280脫色脫腥后,其游離氨基酸態(tài)氮含量為461.7 mg/L,海參多肽含量為9.77 mg/mL。

海參多肽;樹(shù)脂;脫色;脫腥

海參是一種高蛋白、低脂肪、低糖、高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的海產(chǎn)品,含有18種以上的氨基酸和多種維生素及豐富的微量元素,已成為傳統(tǒng)的美味佳肴和保健品[1]。海參有生百脈血、補(bǔ)腎益精、壯陽(yáng)療痿、除勞祛癥、滋陰利水、補(bǔ)正軟堅(jiān)和通腸潤(rùn)燥等多種功能[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明:海參體壁真皮結(jié)締組織、體腔、內(nèi)腺管及內(nèi)臟均含有生物活性物質(zhì),如海參毒素、海參多糖、海參皂苷、脂肪酸、多肽、海參神經(jīng)節(jié)苷酯等[3-5]。海參多肽具有良好的溶解性和穩(wěn)定性,易消化吸收,食用安全,具有降血壓、預(yù)防心腦血管疾病、提高免疫力、抗腫瘤、抗疲勞和抗氧化等生物活性[6]。因此,肽制品已成為海參深度開(kāi)發(fā)的重要方向。

海參本身為棕色或者深褐色,其蛋白酶酶解液的顏色為深灰色,不僅影響了產(chǎn)品的外觀,也有礙于對(duì)產(chǎn)品的深度開(kāi)發(fā),因此,對(duì)海參多肽酶解液進(jìn)行脫色脫腥處理具有重要意義。目前,許多學(xué)者研究了海參多肽的制備及其功能性作用,但對(duì)于海參多肽酶解液脫色脫腥的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中,作者以仿刺參 Apostichopus japonicus為原料,利用具有色素吸附功能的活性炭、硅藻土以及9種樹(shù)脂對(duì)海參多肽酶解液脫色脫腥工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

半干海參購(gòu)于大連商場(chǎng);枯草桿菌中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;粉末活性炭、顆粒活性炭購(gòu)于沈陽(yáng)新興試劑廠;硅藻土購(gòu)于汕頭市西隴化工有限公司;D301R、D380、D315、D280、D301T、ADS-5、ADS-7、D152、D3520 9種樹(shù)脂購(gòu)于天津南開(kāi)和成科技有限公司;三氯乙酸、甲醛、氫氧化鈉、硫酸銅均為分析純。

UV-754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)為上海第三分析儀器廠產(chǎn)品;SBS-100型數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器為上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品;BT00-100M型恒流泵為保定蘭格恒流泵有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 用復(fù)合酶解法制備海參多肽的工藝流程

半干海參→脫鹽→去除內(nèi)壁膜,加入2倍水均質(zhì)→加入枯草桿菌中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解→滅酶→離心得上清液備用。

1.2.2 海參多肽脫色脫腥試驗(yàn)

1)不同脫色劑的脫色脫腥試驗(yàn)。首先將一定量的海參多肽酶解液置于50 mL燒杯中,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的粉末活性炭、顆?；钚蕴俊⒐柙逋?充分?jǐn)嚢韬?調(diào)節(jié)pH至5.0,于60℃下水浴60 min,抽濾得上清液,測(cè)定吸光度,計(jì)算脫色率、氮回收率,并進(jìn)行腥味值感官評(píng)定。

2)粉末活性炭的脫色脫腥正交試驗(yàn)。設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)L9(34),因素水平見(jiàn)表1。

表1 粉末活性炭脫色正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Orthogonal factors and levels table for decolorization by activated carbon powder

3)樹(shù)脂靜態(tài)脫色脫腥試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過(guò)的 9 種 樹(shù)脂 D301R、D380、D315、D280、D301T、ADS-5、ADS-7、D152、D3520各10 mL放入50 mL的錐形瓶中,加入海參多肽酶解液30 mL,在室溫下振蕩2 h后[7],用濾紙過(guò)濾,測(cè)定每種樹(shù)脂上清液的脫色率以及脫色后氨基酸態(tài)氮的回收率和海參多肽的回收率。

4)樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)。取60 mL樹(shù)脂,裝填入層析柱 (30 cm×1.6 cm)中,海參多肽酶解液的體積為 180 mL,用恒流泵分別以 1、2、3 mL/min的流速泵入柱內(nèi)進(jìn)行脫色,用自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集,每管3 mL。收集洗脫液,計(jì)算脫色率以及脫色后氨基酸態(tài)氮的回收率和海參多肽的回收率,并進(jìn)行腥味值的感官評(píng)定。

1.2.3 測(cè)定方法

1)多肽含量和游離氨基酸態(tài)氮含量。用三氯乙酸 (TCA)沉淀法結(jié)合雙縮脲法[8-9]測(cè)定多肽含量;用甲醛滴定法[10]測(cè)定游離氨基酸態(tài)氮含量。

2)脫色率。用722分光光度計(jì)測(cè)定脫色前與脫色后上清液的吸光度值OD0、OD1(波長(zhǎng)為458 nm),計(jì)算脫色率[11]:

脫色率 (%)=(OD0-OD1)/OD0×100。

3)氮回收率。用722分光光度計(jì)測(cè)定酶解液及濾液的吸光度值 OD酶解液、OD濾液(波長(zhǎng)為540 nm),計(jì)算氮回收率[12]:

氮回收率 (%)=OD酶解液/OD濾液×100。

4)海參多肽回收率。計(jì)算公式為

多肽回收率(%)=酶解液脫色后的多肽含量/酶解液脫色前的多肽含量×100。

5)腥味值的感官評(píng)定。以基本無(wú)腥味為10分;略有腥味為8分;腥味較弱為6分;腥味一般為4分;腥味略重為2分;腥味很重即未進(jìn)行脫腥處理為0分。以8人小組評(píng)分,取其平均值[13],脫腥率以百分?jǐn)?shù)形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同脫色劑對(duì)脫色脫腥效果的影響

用粉末活性炭、顆?；钚蕴亢凸柙逋?種脫色劑對(duì)海參多肽酶解液進(jìn)行脫色脫腥,得到的脫色率、氮回收率和脫腥率如圖1所示。由圖1可以看出,在相同的時(shí)間、溫度、脫色劑用量及相同的pH條件下,粉末活性炭、顆?；钚蕴亢凸柙逋?種脫色劑對(duì)海參多肽酶解液都有一定的脫色脫腥效果。其中,粉末活性炭脫色率最高,硅藻土的脫色率最低;粉末活性炭的脫腥效果最佳。考慮到粉末活性炭的脫色率和脫腥效果均較佳,本研究中選用粉末活性炭進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。

圖1 3種脫色劑對(duì)脫色率、氮回收率和脫腥率的影響Fig.1 Effects of decolorant on decolorization rate,re covery of nitrogen and deodorization rate

2.2 粉末活性炭脫色脫腥正交試驗(yàn)

用活性炭粉末作為脫色劑,以pH、粉末活性炭用量、溫度和時(shí)間為因素,以脫色率和氮回收率為指標(biāo),設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 2。由表 2可以看出,脫色率最高達(dá)83.82%,氮回收率最高為49.19%。雖然用活性炭粉末脫色效果較好,但是氮回收率較低,最高也超不過(guò)50%,這樣造成的損失較大,而且呈現(xiàn)出脫色率與氮回收率成反比的關(guān)系,即脫色率較高時(shí)氮回收率卻較低,用粉末活性炭作為脫色劑對(duì)酶解液中含氮化合物吸附也較大。

2.3 靜態(tài)吸附篩選樹(shù)脂

9種樹(shù)脂的脫色效果差異明顯,其中游離氨基酸態(tài)氮濃度為556.5 mg/L時(shí),脫色率、脫色后氨基酸態(tài)氮的回收率和海參多肽回收率以及脫腥效果最佳,如圖2和圖3所示。從圖2可以看出,不同樹(shù)脂的脫色能力差異較大,D301R、D315脫色效果較差,其他樹(shù)脂的脫色效果相對(duì)較明顯。其中,從樹(shù)脂極性來(lái)看,大孔吸附樹(shù)脂ADS-5、ADS-7、D3520的脫色率在60%以上,估計(jì)酶解液中的色素可能為非極性分子;從樹(shù)脂性質(zhì)來(lái)看,陰離子交換樹(shù)脂如 D280、D301T、D380的脫色率也較高(50%～70%),酶解液中的色素有可能屬于陰離子型。因此,樹(shù)脂脫色可能與樹(shù)脂極性有關(guān),也與樹(shù)脂離子有關(guān)[14]。

表2 粉末活性炭脫色脫腥的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Orthogonal test results for decolorization and deodorization by activated carbon powder

圖2 9種樹(shù)脂靜態(tài)脫色脫腥試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The decolorization and deodorization by nine kinds of resins in the static adsorption experiments

氨基酸態(tài)氮回收率和海參多肽回收率同樣也是重要的指標(biāo)。D280、D380兩種樹(shù)脂在氨基酸態(tài)氮濃度為556.5 mg/L時(shí),脫色率分別為58.91%、50.36%,多肽回收率分別為85.52%、95.37%,較其他樹(shù)脂高,且其氨基酸態(tài)氮回收率分別為83.02%、72.41%,略低于非極性大孔吸附樹(shù)脂D3520、ADS-5、ADS-7的氨基酸態(tài)氮回收率。同時(shí)對(duì)9種樹(shù)脂的脫腥效果 (氨基酸態(tài)氮濃度為556.5 mg/L)進(jìn)行了感官評(píng)價(jià),結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可以看出,9種樹(shù)脂的脫腥效果都較好,其中脫腥效果最好的是D3520,D280、D380樹(shù)脂也有較強(qiáng)的脫腥效果。綜合考慮,選用D280、D380樹(shù)脂作為動(dòng)態(tài)試驗(yàn)的脫色劑,其脫色率、氨基酸態(tài)氮回收率和海參多肽回收率都較好。

圖3 9種樹(shù)脂的脫腥效果Fig.3 Deodorization effect of nine kinds of resins

2.4 陰離子離交吸附柱層析分離試驗(yàn)

以D380、D280陰離子樹(shù)脂作為脫色劑,分別用3種不同的流速1、2、3 mL/min在相同試驗(yàn)條件下進(jìn)行陰離子離交吸附柱層析分離試驗(yàn),結(jié)果如圖4、圖5所示。從圖4可以看出,除3 mL/min流速外,其他流速下D280的脫色率都比D380的要高,且游離氨基酸態(tài)氮回收率和海參多肽回收率也比D380的高。從圖5可以看出,D280樹(shù)脂整體脫腥效果優(yōu)于 D380樹(shù)脂。因此,本研究中選用D280為脫色劑。將3種流速下D280的脫色效果進(jìn)行比較,結(jié)果表明,流速為2 mL/min時(shí)D280脫色劑的各項(xiàng)指標(biāo)均較好,脫色率最高,為69.78%,游離氨基酸態(tài)氮回收率為86.42%,海參多肽回收率為82.49%。

圖4 D380、D280樹(shù)脂離交吸附柱層析分離試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Separation of anion-exchange column chromatography on D380 and D280

3 結(jié)論

1)采用粉末活性炭、顆?；钚蕴亢凸柙逋?種脫色劑對(duì)海參多肽酶解液進(jìn)行脫色,粉末活性炭雖然脫色率最高達(dá)83.82%,但是正交試驗(yàn)中的氮回收率卻很低,均不超過(guò)50%。因此,綜合考慮粉末活性炭不適合作為脫色脫腥劑。

圖5 D380、D280陰離子樹(shù)脂的脫腥效果Fig.5 Deodorization effect of D380 and D280

2)通過(guò)樹(shù)脂脫色脫腥試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),海參多肽酶解液中的色素可能是由非極性分子或陰離子型分子所構(gòu)成。最佳脫色脫腥劑為D280,其最佳脫色脫腥工藝為:酶解液與樹(shù)脂體積比為3∶1,流速為2 mL/min。在此條件下,脫色率為69.78%,游離氨基酸態(tài)氮的回收率為86.42%,海參多肽的回收率為82.49%,脫腥率達(dá)67%,脫色后游離氨基酸態(tài)氮的含量為461.7 mg/L,海參多肽的含量為9.77 mg/mL。

[1]Wen J,Hu C.Elemental composition of commercial sea cucumbers (holothurians)[J].Food Additives and Contaminants:Part B, 2010,4(3):246-252.

[2]樊繪曾.海參:海中人參——關(guān)于海參及其成分保健醫(yī)療功能的研究與開(kāi)發(fā)[J].中國(guó)海洋藥物,2001(4):37-42.

[3]姜健,楊寶靈,邰陽(yáng).海參資源及其生物活性物質(zhì)的研究[J].生物技術(shù)通訊,2004,15(5):537-540.

[4]王斌,袁甜,張譯文,等.仿刺參腸多糖提取物對(duì)小鼠實(shí)體瘤的抑制作用[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2012,27(3):195-199.

[5]李明,馬悅欣,劉志明,等.刺參機(jī)體酵母菌組成及其拮抗活性的研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2012,27(5):436-440.

[6]趙興坤.海參肽的功能特性及其應(yīng)用[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng), 2003(12):32-33.

[7]王立東,唐偉,隋明,等.利用樹(shù)脂D392進(jìn)行低聚木糖提取液脫色的研究[J].糧油食品科技,2010,18(3):36-39.

[8]李理,張靜.蛋白水解產(chǎn)物中多肽得率的測(cè)定方法研究[J].現(xiàn)代食品科技,2010,26(8):884-888.

[9]鄒東恢,粱敏,江成英,等.大豆多肽復(fù)合酶解及脫色工藝條件優(yōu)化的研究[J].糧油加工,2007(11):89-92.

[10]寧正祥.食品成分分析手冊(cè)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社, 1997.

[11]陳荔紅,鄭寶東.仙草膠提取液脫色工藝的研究:Ⅱ.活性炭[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2009,17(5):36-40.

[12]王書(shū)云,萬(wàn)菡,周光朝,等.玉米多肽脫色工藝優(yōu)化研究[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,28(4):25-29.

[13]王新廣,張歧,劉軍華,等.馬尾藻提取液脫腥處理的研究[J].中國(guó)食品添加劑,2005(6):10-15.

[14]謝紅旗,周春山.香菇多糖脫色工藝研究[J].離子交換與吸附,2007,23(2):158-165.

Technique optimization of decolorization and deodorization for sea cucumber hydrolysates

ZHENG Jin-wa,WANG Qiu-kuan,HE Yun-hai,LIU Shu,REN Dan-dan

(Key Laboratory of Fishery Product Processing and Utilization of Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

The combined enzymes were applied to hydrolyze sea cucumber Apostichopus japonicus in order to produce sea cucumber peptide hydrolysates which were then decolorized and deodorized by activated carbon powder, activated carbon granule,diatomite,and also strongly basic anion-exchange resin(D280),weakly basic anionexchange resin(D380),weekly acidic cation-exchange resin(D301R,D315,D301T,D152)and macroporousadsorption resin which were all carried through the static adsorption experiments and separation experiments of anion-exchange column chromatography(D3520,ADS-5,ADS-7).The D280 was found to be better for decolorization and deodorization.The orthogonal optimization test of the dynamic elution factors for decolorization revealed that the decolorization rate of 69.78%was detected by dynamic elution test and the deodorization rate of 67%was determined by sensory inspection at the ratio of the enzymatic hydrolysates to resin=3∶1 in volume at flow rate of 2 mL/min,with free amino acid nitrogen recovery of 86.42%and polypeptide recovery of 82.49%.There was free amino acid nitrogen content of 461.7 mg/L and peptide content of 9.77 mg/mL in the hydrolysates in the sea cucumber decolorized and deodorized by D280.

peptide in sea cucumber;resin;decolorization;deodorization

TS254.4

A

2012-10-20

國(guó)家科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目 (2008GB2B000061)

鄭金娃 (1987-),女,碩士研究生。E-mail:418994603@qq.com

汪秋寬 (1962-),女,教授。E-mail:wqk320@dlou.edu.cn

2095-1388(2013)03-0303-04