李倩,練青平,胡廷尖,劉士力,王雨辰,宓國(guó)強(qiáng)

(浙江省淡水水產(chǎn)研究所,浙江湖州313001)

李倩,練青平,胡廷尖,劉士力,王雨辰,宓國(guó)強(qiáng)

(浙江省淡水水產(chǎn)研究所,浙江湖州313001)

利用12對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)花和唇及其正反雜交子代 (花♀×唇♂F1和唇♀×花♂F1)共4個(gè)群體進(jìn)行微衛(wèi)星分析,計(jì)算等位基因數(shù) (Na)、有效等位基因數(shù) (Ne)、多態(tài)性信息含量 (PIC)、觀測(cè)雜合度 (Ho)、期望雜合度 (He)、遺傳分化系數(shù) (Fst)、Nei氏遺傳距離 (DS)。結(jié)果表明:在4個(gè)群體中,反交F1的平均Ne最大 (3.453 7),花的平均Ne最小 (3.049 7);花和唇及其正反雜交子代4個(gè)群體的平均PIC分別為0.599 4、0.602 6、0.628 0、0.637 4;反交F1的平均Ho最高 (0.411 1),花的平均Ho最低 (0.208 3)。聚類(lèi)分析結(jié)果表明,正交F1和母本花先聚為一支,再和父本唇聚為一支,最后同反交F1聚在一起。遺傳距離和遺傳相似系數(shù)結(jié)果顯示:正交F1與母本花的遺傳相似系數(shù)最大,與反交F1的遺傳相似系數(shù)最小;反交F1同父本花的遺傳相似系數(shù)最大,同母本唇的遺傳相似系數(shù)最小。雜交子代群體的等位基因基本來(lái)自父母本雙方,可以推斷雜交子代的遺傳物質(zhì)來(lái)自父母雙方,屬兩性融合生殖,且雜交子代的遺傳變異水平明顯高于父母本,是真正意義上的雜交種。

花;唇;雜交F1;微衛(wèi)星分析

微衛(wèi)星又稱(chēng)簡(jiǎn)單重復(fù)序列 (SSR),是由1～6 bp的簡(jiǎn)單重復(fù)序列組成,廣泛存在于真核生物基因組中,因其具有多態(tài)性豐富、信息含量多、雜合度高、共顯性遺傳、數(shù)量多、分布廣以及檢測(cè)快速方便等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞[16-18]。本研究中,作者以花、唇及其正交和反交 F14個(gè)群體為研究對(duì)象,應(yīng)用12對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了花和唇及其親子代間的遺傳關(guān)系,旨在從分子水平上為其雜種優(yōu)勢(shì)和育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 用常規(guī)苯酚/氯仿/異戊醇法抽提DNA,用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA樣品,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。將DNA溶液稀釋至50 ng/μL,于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選及PCR擴(kuò)增 引物序列及PCR反應(yīng)程序見(jiàn)文獻(xiàn)[19],引物序列和退火溫度見(jiàn)表1。所有引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。PCR反應(yīng)體系25 μL,其中 DNA模板1.0 μL,2×Taq PCR Master Mix(0.1 U/μL Taq polymerase,400 μmol/L dNTP each,20 mmol/L pH 8.3 Tris-HCl,100 mmol/L KCl,3 mmol/L MgCl2,均為康為世紀(jì)有限公司產(chǎn)品)12.5 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL,加滅菌去離子水補(bǔ)至25 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè),上樣量為8 μL,在10 V/cm下電泳3 h左右,參照文獻(xiàn)[20]中的方法進(jìn)行凝膠銀染,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察與拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

微衛(wèi)星屬共顯性遺傳,可從電泳圖譜上直接判別個(gè)體的基因型,用PopGen 3.2軟件[21]統(tǒng)計(jì)各微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù) (Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度 (Ho)、期望雜合度 (He)、遺傳分化系數(shù) (Fst)、Hardy-Weinberg平衡 (PHW)和遺傳距離 (DS)等參數(shù),多態(tài)性信息含量(PIC)的計(jì)算公式[22]為

其中:Pi、Pj分別為群體中第i和第j個(gè)等位基因頻率;n為某一基因座上的等位基因數(shù)。根據(jù)群體間的遺傳距離,用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù) (UPGMA法)。

表1 12對(duì)微衛(wèi)星引物及退火溫度Tab.1 Twelve pairs of microsatellite primers and their annealing temperature

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增

12對(duì)微衛(wèi)星引物均能在父母本和雜交子代中擴(kuò)增出清晰的條帶,且都為多態(tài)性引物。12對(duì)引物在4個(gè)群體中共檢測(cè)到197個(gè)等位基因,在擴(kuò)增條帶數(shù)量上,反交F1數(shù)量最多 (498條),其次是正交F1(459條),唇最少 (441條)。圖1為引物Hma008在4個(gè)群體中的擴(kuò)增結(jié)果。

圖1 引物Hma008在4個(gè)群體中的擴(kuò)增圖Fig.1 Amplified gel electrophoresis of primer Hma008 in the four populations

2.2 等位基因數(shù)、基因雜合度和多態(tài)性信息含量

從表2可見(jiàn):在4個(gè)群體中,反交F1的平均Ne最大 (3.453 7),花的平均 Ne最小(3.049 7);反交 F1的平均Ho最大 (0.411 1),花的平均 Ho最小 (0.208 3)。根據(jù) Botstein等[22]提出的衡量標(biāo)準(zhǔn):當(dāng)PIC＜0.25時(shí),為低度多態(tài)性位點(diǎn);0.25＜PIC＜0.5時(shí),為中度多態(tài)性位點(diǎn); PIC＞0.5時(shí),為高度多態(tài)性位點(diǎn)。從位點(diǎn)來(lái)看,反交F1的Hma007位點(diǎn)的PIC最大 (0.802 4),正交F1的Hma005位點(diǎn)的PIC最小 (0.398 8)。從群體來(lái)看,花、正交F1、唇、反交F14個(gè)群體的 PIC分別為 0.599 4、0.628 0、0.602 6、0.637 4,4個(gè)群體的平均PIC為0.616 9,均為高度多態(tài)性位點(diǎn),說(shuō)明本研究中所選用的12對(duì)引物多態(tài)性豐富,可以用作分析花、唇及其雜交子代的遺傳多樣性。

2.3 群體Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

用基于馬爾夫鏈模型 (Markov chain method)的Hardy-Weinberg精確P值的無(wú)偏估測(cè)對(duì)各群體的基因座進(jìn)行檢測(cè),4個(gè)群體在基因座Hma005、Hma008、Hma012、Hma019、Hma025、Hma029上極顯著地偏離了遺傳平衡 (P＜0.01),其他6個(gè)位點(diǎn)至少在1個(gè)群體中偏離了遺傳平衡,這些偏離平衡的位點(diǎn)是由雜合體缺失引起的 (Fst＞0)。

2.4 群體遺傳分化分析

基于配子間的Fst與基因流 (Nm)分析4個(gè)群體的遺傳分化情況,結(jié)果表明,4個(gè)群體在12個(gè)位點(diǎn)的平均Fst為0.052 1(表3),表明只有5.21%的變異是由群體間分化導(dǎo)致的,而94.79%的變異來(lái)源于群體內(nèi)。除了在基因座Hma001、Hma002、Hma007、Hma008、Hma022、Hma029上的 Fst＜0.05,其余均大于種群間無(wú)遺傳分化的標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 遺傳距離、遺傳相似系數(shù)及聚類(lèi)分析

3 討論

遠(yuǎn)緣雜交是魚(yú)類(lèi)育種的基本手段之一,廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中[23],微衛(wèi)星標(biāo)記在魚(yú)類(lèi)遠(yuǎn)緣雜交育種上有著很好的應(yīng)用。王曉清等[24]對(duì)大黃魚(yú)、鮸以及雜交子代進(jìn)行了微衛(wèi)星和AFLP標(biāo)記的比較分析,結(jié)果表明,雜交子代和母本之間有極高的遺傳同質(zhì)性,屬異精雌核發(fā)育個(gè)體。周翰林等[25]使用6對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)兩種雜交子一代青龍斑和虎龍斑及其親本共5個(gè)群體進(jìn)行微衛(wèi)星分析,結(jié)果表明,雜交子代遺傳物質(zhì)一方來(lái)自父本,一方來(lái)自母本,是真正意義上的雜交種。顏標(biāo)等[26]利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析了尼羅羅非魚(yú)與薩羅羅非魚(yú)及其正反雜交子代的關(guān)系,證明了正反交子代有明顯的雜種優(yōu)勢(shì),雜交子代的DNA具有更豐富的多態(tài)性。本研究中使用的12對(duì)微衛(wèi)星引物中,有11對(duì)引物

在4個(gè)群體中均表現(xiàn)為高度多態(tài),高度多態(tài)比例為91.7%,表明這12對(duì)微衛(wèi)星引物可靠性較高,可以作為分析遺傳變異的標(biāo)記。尤其是Hma002和Hma007,在正反交子代中的PIC接近或大于0.7,可以作為理想的遺傳標(biāo)記[27]。在4個(gè)群體中,正反交子代的平均PIC分別為0.628 0、0.637 4,大于父母本,表明雜交子代具有更豐富的DNA多態(tài)性。

表2 4個(gè)群體的遺傳變異參數(shù)Tab.2 Variation parameters in the four populations

表3 4個(gè)群體在12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的固定系數(shù)、遺傳分化系數(shù)和基因流Tab.3 The values of Fis,Fstand Nm for twelve microsatellite loci in the four populations

表4 4個(gè)群體間的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)Tab.4 Genetic distances and genetic similarity among the four populations

圖2 4個(gè)群體的UPGMA聚類(lèi)分析圖Fig.2 Cluster dengrogram of the four populations using UPGMA method

當(dāng)種群處于H-D平衡時(shí),各等位基因在群體中的分布頻率應(yīng)該是相對(duì)穩(wěn)定的,觀測(cè)雜合度和期望雜合度之間沒(méi)有顯著的差異。本研究結(jié)果顯示,有6個(gè)基因座偏離了H-D平衡,且觀測(cè)雜合度顯著小于期望雜合度。究其原因,父母本均為養(yǎng)殖群體,且親本數(shù)量較少,經(jīng)過(guò)小群體近交繁殖,造成了部分稀有等位基因的丟失,從而在群體中出現(xiàn)了雜合子缺失。一般認(rèn)為,群體之間的Nm＞1時(shí),群體就可以抵抗由于遺傳漂變?cè)斐傻挠绊慬28],本研究中的Nm=2.7660～7.9252,平均Nm為4.544 9 (表3),排除了遺傳漂變對(duì)群體的影響,表明群體間存在持續(xù)的基因交流。

雜合度又稱(chēng)為基因多樣度,其大小可以反映群體遺傳變異的高低[29]。雜合度高的生物群體具有更大的適應(yīng)環(huán)境變化和自然選擇的能力[30-32]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),正反交子代的Ho和He均大于父母本,正反交子代遺傳了父母本大部分條帶,且數(shù)量多于父母本,可見(jiàn)雜交子代的雜合度得到了提高,后代較高的雜合度一方面來(lái)自父母本雙方的遺傳基因,另一方面又來(lái)自雜交子代的遺傳變異,這也是形成雜種優(yōu)勢(shì)重要的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

本研究中應(yīng)用12對(duì)微衛(wèi)星引物的研究結(jié)果表明,所檢測(cè)的正反交子代的等位基因基本上來(lái)自父母本,雖然丟失了父母本部分等位基因,同時(shí)也出現(xiàn)了一些新的等位基因,但總體上遵循孟德?tīng)柗蛛x規(guī)律,是真正意義上的雜交子代。一般認(rèn)為,PIC高、雜合度大,說(shuō)明群體內(nèi)基因一致性差、遺傳變異大、選擇潛力也大;反之亦然[35]。從本研究結(jié)果可以看出,唇♀×花♂ F1和親本的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),PIC和雜合度最高,可考慮作為更具育種潛力的候選群體。同時(shí),作者也對(duì)反交子代的生長(zhǎng)性能進(jìn)行了跟蹤研究,結(jié)果表明,反交F1在生長(zhǎng)性能上較父母本均有優(yōu)勢(shì),表現(xiàn)出一定的雜種優(yōu)勢(shì),有關(guān)正交子代的生長(zhǎng)性能還有待進(jìn)一步研究。

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Microsatellite analysis of Hemibarbus maculates,H.labeo and their reciprocal hybrids

LI Qian,LIAN Qing-ping,HU Ting-jian,LIU Shi-li,WANG Yu-chen,MI Guo-qiang

(Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries,Huzhou 313001,China)

Twelve pairs of microsatellite primers were used to analyze genetic structure of Hemibarbus maculates, H.labeo and their reciprocal hybrids,and number of alleles(Na),effective alleles(Ne),polymorphic information content(PIC),observed(Ho)and expected(He)heterozygosity values,genetic similarity index and Nei's genetic distance were all detected.It was foud that the F1of H.labeo♀×H.maculates♂showed the most effective alleles (3.453 7),while the H.maculates showed the least(3.049 7).The average values of PIC were 0.599 4 in H.maculates,0.602 6 in H.labeo,0.628 0 in H.maculates♀×H.labeo♂)and 0.637 4 in H.labeo♀×H.maculates♂.The H.labeo♀×H.maculates♂F1generations showed the maximal observed heterozygosity(Ho) (0.411 1),while H.maculates showed the minimal value of 0.208 3.The cluster results showed H.maculates♀× H.labeo♂F1and H.maculates were clustered together firstly and then with H.labeo together,and secondly with F1of H.labeo♀×H.maculates♂.The genetic distances and genetic similarity showed both F1progenies had a close relationship with the parent H.maculates,and H.labeo♀×H.maculates♂F1had the least value of genetic similarity with the female H.labeo parent which had the maxmal value of genetic similarity with the male H.maculates parent. The alleles of F1generations were mostly generated from their parents,indicating that the genetic materials were inherited from parents.The both F1had higher level of genetic variability than their parents and its real hybrids did.

Hemibarbus maculates;Hemibarbus labeo;hybrid F1;microsatellite analysis

Q959.46

A

2012-10-12

浙江省科技廳公益性項(xiàng)目 (2011C22067);浙江省湖州市科技局科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目 (2011GN04);浙江省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目 (2011R50029)

李倩 (1984-),女,碩士,助理工程師。E-mail:2008feelkaka@sina.com.cn

宓國(guó)強(qiáng) (1960-),男,教授級(jí)高級(jí)工程師。E-mail:zjmgq@163.com

2095-1388(2013)03-0241-06