王尉，樂勝鋒，王覃，2，趙新穎，3，張經(jīng)華

（1.北京市理化分析測試中心，北京 100089；2.北京化工大學(xué)，北京100029；3.北京理工大學(xué)，北京 100081）

橘子果肉中橙皮苷的提取及含量測定

王尉1，樂勝鋒1，王覃1，2，趙新穎1，3，張經(jīng)華1

（1.北京市理化分析測試中心，北京 100089；2.北京化工大學(xué)，北京100029；3.北京理工大學(xué)，北京 100081）

采用索氏提取的方法對橘子果肉中橙皮苷進(jìn)行提取，對提取溶劑、提取溫度、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并在該基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：橙皮苷最佳的索氏提取工藝為甲醇作溶劑提取、提取溫度85℃、提取時(shí)間3h、料液比1∶120，橘子果肉中橙皮苷的含量為2.21mg/g（鮮重）。該方法準(zhǔn)確，可靠，可用于橘子中功效成分合理開發(fā)和質(zhì)量控制。

橘子；橙皮苷；索氏提取；高效液相色譜

0 引言

通過研究發(fā)現(xiàn)柑橘屬植物中含有豐富的黃酮類化合物，其中有文獻(xiàn)報(bào)道[1]橙皮苷是該植物中重要的活性成分，具有清除氧自由基[2]、抗腫瘤[3]、抗病毒[4]、抗炎[5]、降低血脂、保護(hù)心血管[6]等多種功效。

橙皮苷一直是天然食用添加劑和保健食品的活性成分，常被選為指標(biāo)成分而用于定性和定量分析。目前橙皮苷的檢測主要針對枳實(shí)[7]、陳皮[8]等樣品，并沒有橘子果肉中含量測定的研究報(bào)道。因此，本文選取橘子的果肉為研究對象，通過提取方法的優(yōu)化，采用HPLC測定了橙皮苷的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橘子（市售，北京）；橙皮苷（標(biāo)準(zhǔn)品），北京市理化分析測試中心研制，純度98.38%；甲醇（色譜純），美國Fisher Scientific公司；水（雙蒸水），實(shí)驗(yàn)室自制；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀（配SPD-M20A檢測器）（日本Shimadzu公司）；ALPHA 1～2 plus冷凍干燥機(jī)（德國CHRIST公司）；CR22GⅢ離心機(jī)（日本Hitachi公司）。

1.3方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

橘子去皮，稱取一定量橘子果肉，榨汁，離心。上清液定容；沉淀部分冷凍干燥，粉碎，備用。

1.3.2 橙皮苷提取的優(yōu)化

對沉淀部分的索氏提取條件進(jìn)行優(yōu)化，首先比較不同提取溶劑對橙皮苷的提取率，即提取所得橙皮苷的質(zhì)量占沉淀部分干重的比例；再對提取溫度、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行正交試驗(yàn)，通過方差分析，優(yōu)選橙皮苷最佳的提取工藝參數(shù)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

稱取橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品5mg置于25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得0.2mg/mL橙皮苷溶液。再從其中分別吸取8，6，4，2mL置于4個(gè)10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，則濃度依次為0.16，0.12，0.08，0.04mg/mL的橙皮苷溶液。

1.3.4 橘子果肉中橙皮苷的測定方法

色譜柱：Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm×5μm）；流動(dòng)相：0.2%磷酸溶液（A）-甲醇（B），線性梯度洗脫，20%B～80%B（0～30min），80%B（30～40min）；流速：1mL/min；檢測波長：284nm；柱溫：30℃。分別測定上清液和沉淀部分提取液的橙皮苷含量，計(jì)算加和后即為橘子果肉中橙皮苷的總含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的確定

分別采用60%、80%、100%的甲醇和乙醇對橙皮苷進(jìn)行索氏提取，提取溫度80℃、提取時(shí)間2h、料液比1∶100。不同溶劑提取效果見表1，其中100%甲醇的提取量最高，更有利于橘子果肉中橙皮苷的溶出。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取溫度對提取率的影響

橙皮苷在常溫下微溶于甲醇，溫度升高有利于橙皮苷的提取。圖1表明，溫度升高橙皮苷溶解度隨之增加，當(dāng)溫度達(dá)85℃時(shí)提取率最高，但溫度達(dá)到90℃時(shí)提取率呈下降的趨勢，這可能是由于過高的溫度導(dǎo)致其他雜質(zhì)的溶出，從而抑制了橙皮苷的提取，因此確定提取溫度為85℃。

表1 不同溶劑的提取效果

2.2.2 提取時(shí)間對提取率的影響

索氏提取的提取時(shí)間與回流次數(shù)呈正相關(guān)，由圖2可知，提取時(shí)間超過3h后提取率則呈現(xiàn)下降趨勢，原因可能是提取時(shí)間過長導(dǎo)致橙皮苷的結(jié)構(gòu)變化，故本實(shí)驗(yàn)選取3h為最佳提取時(shí)間。

2.2.3 料液比對提取率的影響

從圖3看出，在料液比達(dá)到1∶100之前，提取率隨提取液用量的增加而增加，當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí)，提取率基本保持不變，這主要是由于索氏提取每次回流提取過程均為新鮮溶劑，過量的溶劑對橙皮苷溶出沒有明顯作用。

2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以甲醇為提取溶劑，選取提取溫度、提取時(shí)間和料液比3個(gè)因素（見表2），采用正交試驗(yàn)，尋找最佳的提取條件組合，結(jié)果見表3。

由表2分析可知，影響橙皮苷提取率的主次因素順序?yàn)锳BC，最佳工藝條件為A2B2C3，即提取溫度85℃，提取時(shí)間3h，料液比1∶120。在該提取條件下，測得橘子果肉中橙皮苷的提取率為2.47%。同時(shí)，對提取后的樣品進(jìn)行第2次提取，未檢測到橙皮苷成分，說明采用最佳工藝條件通過一次提取即可將橙皮苷提取完全。

2.4 線性范圍、檢出限與加標(biāo)回收率試驗(yàn)

將濃度為0.16，0.12，0.08，0.04mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)行HPLC分析，以進(jìn)樣量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=9170185x+4621，r2=0.9999。結(jié)果表明，橙皮苷樣品在0.04～0.16mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。同時(shí)，測定得到橙皮苷的最低檢出限（S/N=3）為0.16μg/L。

圖1 提取溫度對提取率的影響

圖2 提取時(shí)間對提取率的影響

圖3 料液比對提取率的影響

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 橙皮苷提取率的正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

對已知含量的同一樣品分別添加3種不同質(zhì)量濃度的橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度水平樣品重復(fù)6次，按照2.3所得最優(yōu)工藝條件進(jìn)行提取，并進(jìn)行橙皮苷含量測定，計(jì)算加標(biāo)回收率（見表4）。結(jié)果表明，3種水平的加標(biāo)回收率均大于95.0%，說明本法較準(zhǔn)確，適合該樣品的含量測定。

表4 橙皮苷的加標(biāo)回收率（n=6）

2.5 樣品含量測定

按照最佳工藝平行提取6個(gè)樣品，分別測定上清液和沉淀部分提取液的橙皮苷含量（見圖4），計(jì)算加和后即為橘子果肉中橙皮苷的總含量（見表5）。

3 結(jié)束語

采用離心固液分離、冷凍干燥的方法處理橘子果肉樣品，并根據(jù)正交試驗(yàn)得出了橙皮苷提取的最佳工藝，即提取溫度85℃，提取時(shí)間3h，料液比1∶120。本研究建立的橙皮苷HPLC分析方法，快速、準(zhǔn)確。同時(shí)，結(jié)果表明，橘子果肉中含有較高的橙皮苷，其含量為2.21mg/g（鮮重），為橘子果肉的保健食品開發(fā)和應(yīng)用提供了參考。

圖4 橙皮苷HPLC色譜圖

表5 果肉中橙皮苷含量

[1]趙雪梅，朱大元，葉興乾，等.柑桔屬中類黃酮的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，14（1）：89-92.

[2]陳平，樊瑞勝，聶芊，等.橙皮苷磺酸鈉對自由基清除能力的研究[J].食品科技，2007，28（9）：64-69.

[3]Amirhosein A，Seyed J H，F(xiàn)arshad N，et al.Chemoprotective effects of Hesperidin against genotoxicity Induced by cyclophosphamide in mice bonemarrow Cells[J]. Archives and Pharmacal Research，2008，31（6）：794-797.

[4]Matook S M，Toshihiko S.Antioxidant and antimicrobial activities of the methanol extracts from pummelo（Citrus grandis Osbeck）fruit albedo tissues[J].European Food Research Technology，2006，224（1）：39-47.

[5]Shailja S，Bhawna A，Stuti B，et al.Antioxidant,antiinflammatory and analgesic potential of the Citrus decumana L.peel extract[J].Inflammopharmacology，2009，17（5）：267-274.

[6]Masaki Y，Atsushi S，Hiroko J，et al.Glucosyl hesperidin prevents endothelial dysfunction and oxidative stress in spontaneously hypertensive rats[J].Nutrition，2008，24（5）：470-476.

[7]童榮生，孫世明，吳齊賢.RP-HPLC測定枳實(shí)中橙皮苷的含量[J].華西藥學(xué)雜志，2000，15（6）：454-455.

[8]孫冬梅，畢曉黎，胥愛麗，等.HPLC測定陳皮提取物及制劑中橙皮苷的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15（11）：1-3.

Extraction and determ ination of hesperidin in orange pulp

WANG Wei1，LE Sheng-feng1，WANG Tan1，2，ZHAO Xin-ying1，3，ZHANG Jing-hua1
（1.Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis，Beijing 100089，China；
2.Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China；
3.Beijing Institute of Technology，Beijing 100081，China）

Soxhlet extration was applied to extract hesperidin from orange pulps.The effects of reagent，temperature，time，and material-liquid ratio on the extraction yield of hesperidin were investigated，and the extraction process conditions were optimized by single factor and orthogonal experiments.The optimum process conditions were：extract temperature 85℃，extract time 3.5 h，material-liquid ratio 1∶120 with methanol.The analytical result showed that the content of hesperidin in orange pulp was 2.21mg/g（fresh weight）.The method is accurate and reliable，and may be used for the development of functional components and the quality control of orange.

orange；hesperidin；soxhlet extration；high performance liquid chromatography（HPLC）

S666.2；O629.13；O657.7+2；TS207.3

A

1674-5124（2013）03-0051-03

2012-10-26；

：2012-12-19

國家質(zhì)檢總局公益性行業(yè)科研發(fā)展專項(xiàng)（201210209）北京市市級財(cái)政專項(xiàng)（PXM2012_178305_000006）

王尉（1984-），男，北京市人，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分離純化。