劉曉英, 劉光榮, 朱晨瑜, 何聰芬,*, 祝 鈞

(1.無(wú)限極(中國(guó))有限公司,廣東廣州 510665;2.北京工商大學(xué)北京市植物資源研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100048)

苦瓜(Momordica charantia L.)別名涼瓜、癩瓜、錦荔枝等,葫蘆科屬一年生蔓性草本植物.之所以呈甘苦味是因?yàn)槠浜辛_漢果苷和苦瓜素等成分[1].大量研究證明,苦瓜具有輔助降血糖、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等功效[2-6],另外以苦瓜果汁對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行治療可以使血清中非酯化膽固醇、磷脂及甘油三酯水平降低,高密度脂蛋白-膽固醇水平升高,趨于正常.進(jìn)一步研究證明,苦瓜能夠減少甘油三酯分泌以及微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的mRNA的表達(dá),是栽脂蛋白B的分泌以及甘油三酯的合成分泌的抑制劑,具有一定的預(yù)防肥胖的功效[7-9].對(duì)苦瓜提取物(由無(wú)限極有限公司提供)的健美功效及安全性進(jìn)行研究.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦瓜提取液,實(shí)驗(yàn)中用蒸餾水或其他溶劑將苦瓜提取物配置為1.0,5.0,10.0,30.0,50.0 mg/mL溶液;雞血紅細(xì)胞,無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí),北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;NaCl,甲醇,丙醇均為分析純,北京化學(xué)試劑公司;十二烷基硫酸鈉,分析純,北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司;斑試器,圓形,直徑12 mm,北京北醫(yī)投資管理有限公司;L-抗壞血酸2-葡糖苷(ascorbic acid 2-glucoside,AA2G),原料級(jí),北京貝麗萊斯生物化學(xué)有限公司;豚鼠,原料級(jí),北京軍事醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心;W1002-2-500型甘油測(cè)定試劑盒,北京科達(dá)宏偉生物技術(shù)有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

4K15型冷凍離心機(jī),美國(guó)Sigma公司;Purelab Vltra型超純水機(jī),英國(guó)ELGA公司;UV2300型紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司;FMe-100B型搖床,上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SMZ1000型解剖顯微鏡,日本NIKON公司;SHP-150型生化培養(yǎng)箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;MINI-V/PCR型超凈工作臺(tái),上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;FT-ZDQ型手提快速照蛋器,北京春明方通電子有限公司;MSE-1600型透皮吸收儀,天津市正通科技有限公司;SN151000377C型酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo Science Multiskan Go公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 功效性實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 透皮吸收實(shí)驗(yàn)

透皮吸收實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[10-11].向透皮吸收儀恒溫槽中加入適量水,開啟電源和恒溫槽磁力攪拌,設(shè)定恒溫槽中水溫為37士0.1℃.將制備好的鼠皮用鐵夾子固定在兩室擴(kuò)散池之間,向垂直擴(kuò)散池的接受池內(nèi)加入5.0 mL接受液,放入透皮吸收儀恒溫槽中預(yù)熱,設(shè)定接受池?cái)嚢杷俣葹?00 r/min.向供給池內(nèi)分別加入供給液(即待測(cè)苦瓜提取液),以保鮮膜封住上口.開始記時(shí),當(dāng)樣品滲透0.5,1,1.5,2,3,4 h時(shí),分別取樣0.5 mL置具塞離心管中,在最大吸收峰處測(cè)量吸光度(實(shí)驗(yàn)中測(cè)得苦瓜提取物在490 nm處出現(xiàn)最大吸收峰),計(jì)算透光量.累計(jì)透過(guò)量計(jì)算見公式(1).

式(1)中,Q為累積透過(guò)量,mg/cm2;S為透皮擴(kuò)散面積,cm2;V1為Franz擴(kuò)散池接受液體積,mL;ρn為第n次取樣時(shí)接受液的質(zhì)量濃度,mg/mL;ρi為第i次取樣時(shí)接受液的質(zhì)量濃度,mg/mL;V2為取樣量,mL.通過(guò)式(1)計(jì)算后,作出累積量與時(shí)間的曲線圖,及最終透過(guò)累積量.

1.3.1.2 促進(jìn)脂肪分解能力實(shí)驗(yàn)

按1 g/mL的比例加入制備好的脂肪底物與待測(cè)苦瓜提取液,37℃反應(yīng)2 h,取10 μL,加入190 μL工作液(甘油含量測(cè)定試劑盒內(nèi)含),37℃反應(yīng)10 min.550 nm下測(cè)透光值,將其帶入甘油含量標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算甘油增加量,依此分析脂肪被分解程度.

1.3.1.3 脂肪酸合酶抑制實(shí)驗(yàn)

脂肪酸合酶抑制實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[12-14].將10 μL待測(cè)苦瓜提取液加入由1.8 mL磷酸緩沖液,25 μL 乙酰輔酶 A,50 μL 丙二酰輔酶 A,50 μL 還原型輔酶Ⅱ(triphosphopyridine nucleotide,NADPH)以及脂肪酸合酶組成的活性體系中,在340 nm下連續(xù)測(cè)定NADPH的質(zhì)量濃度變化,進(jìn)而計(jì)算樣液對(duì)脂肪酸合酶的抑制作用情況.

1.3.2 安全性實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)

紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[15-16].用質(zhì)量比為0.1%的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl-sulfate,SDS)檢測(cè)所采集紅細(xì)胞的完整性,同時(shí)在顯微鏡下觀察紅細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞膜的完整性.將樣品用磷酸鹽緩沖液(PBS)分別稀釋成待測(cè)質(zhì)量濃度,用其檢測(cè)樣品的刺激性.實(shí)驗(yàn)分為2組:1)陽(yáng)性對(duì)照組(0.1%SDS)和2)待測(cè)苦瓜提取液組.

1.3.2.2 雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)

雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[17-19].采用6 d齡雞胚放入(37.5 ±0.5)℃,相對(duì)濕度為60% ～80%的恒溫孵箱中孵育1 d,標(biāo)記、開窗放入無(wú)菌中速定性濾紙小片(直徑5 mm),然后用滅菌透明膠封口,培養(yǎng)24 h后,加待測(cè)苦瓜提取液(溶劑換為生理鹽水),設(shè)置0.1%的SDS為陽(yáng)性對(duì)照組,生理鹽水為陰性對(duì)照組.加樣劑量為每次100 μL,每天1次,共3 d.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,雞胚絨毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)用甲醇∶丙酮 =1 ∶1(v∶v)的固定液固定,用眼科鑷去掉CAM平面以上的卵殼及卵殼膜,完整剪下CAM,標(biāo)記藥膜中心點(diǎn),拍照觀察.

1.3.2.3 人體斑貼實(shí)驗(yàn)

人體斑貼實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[20-21].用待測(cè)苦瓜提取液浸潤(rùn)濾紙后放入斑試器內(nèi),對(duì)照孔為空白對(duì)照(不置任何物質(zhì)).將樣品和空白對(duì)照均貼于受試者的前臂曲側(cè),用手掌輕壓使之均勻地貼敷于皮膚上,持續(xù)24 h,去除斑試器后間隔30 min,待壓痕消失后觀察皮膚反應(yīng).在除去斑試器48 h后再觀察一次皮膚反應(yīng).

2 結(jié)果與分析

2.1 功效性檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 透皮吸收實(shí)驗(yàn)

圖1 苦瓜提取物隨時(shí)間變化的累積透過(guò)量Fig.1 Cumulative penetration change with time of Momordica charantia extracts

樣品在不同質(zhì)量濃度下的透過(guò)累積量隨時(shí)間的增加均呈遞增趨勢(shì),說(shuō)明苦瓜提取物有透皮吸收效果(見圖1);隨質(zhì)量濃度的增加,樣品的透過(guò)率逐漸降低(見表1).綜合透過(guò)累積量與透過(guò)率2個(gè)因素得出,樣品起始質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)效果最佳.

表1 苦瓜提取物的透過(guò)率Tab.1 Transmittance of Momordica charantia extracts

2.1.2 促進(jìn)脂肪分解能力實(shí)驗(yàn)

苦瓜提取物能夠促進(jìn)底物中的脂肪分解,使甘油含量上升,說(shuō)明該提取物具有促進(jìn)脂肪分解的能力,且隨質(zhì)量濃度的增高而增高(見圖2).但即使在最大質(zhì)量濃度50.0 mg/mL時(shí)也未達(dá)到50%.

圖2 苦瓜提取物促進(jìn)脂肪分解能力實(shí)驗(yàn)Fig.2 Experiment of promoting lipolysis of Momordica charantia extracts

2.1.3 脂肪酸合酶抑制實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示,苦瓜提取物對(duì)脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)有抑制作用,且隨著質(zhì)量濃度的加大,抑制作用加強(qiáng),見圖3.說(shuō)明苦瓜提取物能夠抑制脂肪的合成,當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到50.0 mg/mL時(shí)FAS抑制率達(dá)到50.50%.

圖3 苦瓜提取物FAS抑制實(shí)驗(yàn)Fig.3 Experiment of inhibiting fatty acid synthase of Momordica charantia extracts

2.2 安全性檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 紅細(xì)胞溶血性實(shí)驗(yàn)

按照RBC Test System方法中對(duì)結(jié)果的判定:若樣品溶血率高于20%,則判定為有刺激性,若低于則無(wú)刺激性.結(jié)果顯示,50.0,30.0 mg/mL的苦瓜提取物的溶血率較高,均大于界值20%,對(duì)紅細(xì)胞的刺激性較大;10.0,5.0,1.0 mg/mL樣液溶血率均低于20%,可判定無(wú)刺激性,見圖4.

圖4 苦瓜提取物紅細(xì)胞溶血性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Red blood cell hemolysis test of Momordica charantia extracts

2.2.2 雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)

圖5是陰性對(duì)照組,各組雞胚大多數(shù)血管較少,甚至可見無(wú)血管區(qū)域.載體放置區(qū)域多為無(wú)血管區(qū)或血管較少的分布區(qū),可見雞胚血管細(xì)小,微血管生成較少.圖6是陽(yáng)性對(duì)照組,雞胚已完全死亡.圖7a至圖7e為苦瓜樣液組,其中圖7a為加樣質(zhì)量濃度1 mg/mL組,與陰性對(duì)照組比較,血管數(shù)目略有增加,血管分支數(shù)也有所增加;圖7b為加樣質(zhì)量濃度5 mg/mL組,血管數(shù)目與分支數(shù)較1 mg/mL質(zhì)量濃度組進(jìn)一步增加,分布較零亂;圖7c為加樣質(zhì)量濃度10 mg/mL組,較5 mg/mL組血管零亂程度加重,各藥物組CAM血管開始向載體生長(zhǎng)集中;圖7d為加樣質(zhì)量濃度30 mg/mL組,較10 mg/mL質(zhì)量濃度組,血管管徑增寬,分布零亂無(wú)序,出現(xiàn)斷裂血管,且平行實(shí)驗(yàn)中一只在距第一次加樣72 h后死亡;圖7e為加樣質(zhì)量濃度50 mg/mL組,可明顯看出溶血現(xiàn)象,且平行實(shí)驗(yàn)中一只在距第一次加樣48 h后即死亡.綜上可見,苦瓜提取物的刺激性依質(zhì)量濃度的增加而增加,在低質(zhì)量濃度時(shí)刺激性較小,但是在高質(zhì)量濃度,如30,50 mg/mL時(shí)刺激性比較大,甚至?xí)霈F(xiàn)雞胚致死現(xiàn)象,見表2.

2.2.3 人體斑貼實(shí)驗(yàn)

對(duì)苦瓜提取物進(jìn)行人體斑貼實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表3,此次實(shí)驗(yàn)中苦瓜提取物斑貼實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合《化妝品接觸性皮炎診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》的要求.

表2 苦瓜提取物對(duì)雞胚存活情況的影響Tab.2 Effect of Momordica charantia extracts on survival condition of chicken embryoes

圖5 陰性對(duì)照(生理鹽水)Fig.5 Negative contrast(normal saline)

圖6 陽(yáng)性對(duì)照(0.1%SDS)Fig.6 Positive contrast(0.1%SDS)

圖7 不同質(zhì)量濃度苦瓜樣液的雞胚絨毛尿囊膜Fig.7 Different concentrations of Momordica charantia extracts for chicken embryo villus allantoic membrane

表3 苦瓜提取物人體斑貼實(shí)驗(yàn)Tab.3 Patch test of Momordica charantia extracts

3 結(jié) 論

透皮吸收實(shí)驗(yàn)證實(shí),各質(zhì)量濃度的苦瓜提取物均能夠透過(guò)皮膚;促進(jìn)脂肪分解能力實(shí)驗(yàn)與脂肪酸和酶抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)該提取物具有促進(jìn)脂肪分解的能力與抑制脂肪合成的能力.體外安全性實(shí)驗(yàn)——紅細(xì)胞溶血性實(shí)驗(yàn)與雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示苦瓜提取物在較低質(zhì)量濃度即1,5,10 mg/mL時(shí)安全無(wú)刺激;人體斑貼實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該提取物在任意檢測(cè)質(zhì)量濃度下對(duì)人體均無(wú)刺激性.經(jīng)過(guò)一系列的功效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)和安全性研究,確定苦瓜提取物具有一定的健美功效,且在較低質(zhì)量濃度下安全無(wú)刺激,推薦選取10 mg/mL作為外用健美產(chǎn)品的添加量.

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