何玉財(cái)，徐曉鋒，潘雪鶴，巫淼鑫

（1.常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究室，常州213164；2.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237）

一株乙二醇氧化酶菌株的篩選及催化特性的初步研究

何玉財(cái)1，2，徐曉鋒1，潘雪鶴1，巫淼鑫1

（1.常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究室，常州213164；2.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237）

利用富集培養(yǎng)技術(shù)從土壤中篩選獲得1株高活性二醇氧化活性菌株Brevibacterium sp.CCZU12-1。以Brevibacterium sp.CCZU12-1靜息細(xì)胞為催化劑，最適催化反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH和金屬離子添加量分別為30℃、6.5和Mn2＋0.1 mmol／L。在最佳條件下，轉(zhuǎn)化200 mmol／L乙二醇24 h，羥基乙酸的產(chǎn)率為94.6%，分批補(bǔ)料乙二醇5批，羥基乙酸的累積濃度為972 mmol／L。

氧化；乙二醇；羥基乙酸；Brevibacterium

α-羥基酸是一類重要的化合物［1-9］，其中羥基乙酸（HOCH2COOH）是最簡(jiǎn)單的α-羥基酸，被廣泛地應(yīng)用于日化、紡織和醫(yī)藥等行業(yè)，不僅可以作為家用和工業(yè)用的清洗劑，還可以用作黏結(jié)劑、焊接劑、破乳劑和涂料的配料及合成多種農(nóng)藥、醫(yī)藥和化學(xué)助劑，市場(chǎng)需求量大［2-4］。工業(yè)上，生產(chǎn)羥基乙酸主要通過(guò)化學(xué)方法（包括氯乙酸氧化法、甲醛羰基化法和甲醛氰化法等），通常需要在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿、高溫、高壓等反應(yīng)條件下進(jìn)行［6］。而生物催化合成羥基乙酸具有反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)［5-7］，符合綠色化學(xué)發(fā)展的要求。生物氧化法可實(shí)現(xiàn)二醇的選擇性氧化，實(shí)現(xiàn)羥基羧酸的合成，然而報(bào)道的酶源較少［8-9］。另外，乙二醇是一種便宜的原料［8］，可經(jīng)生物氧化法實(shí)現(xiàn)羥基乙酸低成本合成。因此，擴(kuò)大篩選新的酶源催化氧化乙二醇實(shí)現(xiàn)羥基乙酸的高效合成具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

筆者利用改進(jìn)的羥肟酸鐵比色法［10-11］建立了二醇氧化酶的高通量篩選方法，并以此從土壤中獲得具有乙二醇氧化酶活性的菌株Brevibacterium sp. CCZU12-1，同時(shí)考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH和金屬離子添加劑等對(duì)酶催化活性的影響，以期為該菌的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

UV-2100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HH-2XSZ-G型恒溫水浴鍋（金壇市虹盛儀器廠）；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；LC-10AT VP高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 試劑

乙二醇（分析純）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，蛋白胨、酵母膏為生物級(jí)，其他試劑為市售分析純。

高氯酸羥胺（HAP）、N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）和高氯酸鐵溶液（0.070 mol／L）參照文獻(xiàn)［10］方法配制。

1.3 土樣

土樣在常州大學(xué)白云校區(qū)化工樓周?chē)杉?/p>

1.4 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基1：苯乙二醇5 mmol／L，（NH4）2SO42 g／L，KH2PO42 g／L，NaCl 1 g／L，MgSO40.2 g／L。

富集培養(yǎng)基2：乙二醇5 mmol／L，（NH4）2SO42 g／L，KH2PO42 g／L，NaCl 1 g／L，MgSO40.2 g／L。

基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：葡萄糖15 g／L，蛋白胨10 g／L，酵母膏5 g／L，KH2PO42 g／L，NaCl 1 g／L，MgSO40.2 g／L。

以上培養(yǎng)基調(diào)pH至6.5，121℃滅菌15 min后，待用。

1.5 目標(biāo)菌株的篩選

將采集的土樣0.1 g分別制備成2 mL土壤懸液，取0.1 mL土壤懸液加入到3 mL富集培養(yǎng)基1或富集培養(yǎng)基2中，30℃、160 r／min搖床上培養(yǎng)48 h后，取200μL培養(yǎng)液，進(jìn)行離心（10 000 g，5 min），然后取上清液40μL至24孔板中，利用羥肟酸鐵比色法［10］進(jìn)行有機(jī)羧酸的檢測(cè)。

1.6 菌株的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化反應(yīng)

利用發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)Brevibacterium sp.CCZU12-1在30℃、160 r／min恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)48 h后，離心（10 000 g，5min）培養(yǎng)液得到靜息細(xì)胞，利用生理鹽水將靜息細(xì)胞洗滌3次，然后將1.0 g濕細(xì)胞重新懸浮于10 mL H3PO4緩沖溶液（pH 6.5，100 mmol／L）中，加入終濃度為200 mmol／L乙二醇，在30℃和160 r／min的恒溫?fù)u床振蕩反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程中不同反應(yīng)時(shí)間取樣150μL，立即加入50μL的2 mol／L HCl終止反應(yīng)，充分振蕩混勻，離心取上清液，進(jìn)行產(chǎn)物分析。

1.7 檢測(cè)方法

離心后的反應(yīng)液經(jīng)微孔濾膜（0.22μm）過(guò)濾后，利用HPLC（LC-10AT VP，日本Shimadzu公司）分析。C18柱（Shim?pack VP-ODS，日本Shimadzu公司）用于檢測(cè)羥基乙酸的濃度，流動(dòng)相為20 mmol／L KH2PO4（pH 2.5），流速為0.5 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。

酶活單位的定義：在30℃、pH為6.5條件下，1 min轉(zhuǎn)化乙二醇生成1μmol羥基乙酸所需要的催化劑的量（DCW，細(xì)胞干質(zhì)量）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.8 16S rDNA序列分析法

采用16S rDNA序列分析法進(jìn)行菌種鑒定［4，12］。將測(cè)定的16S rDNA序列用BLASTN與GenBank中已知的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 活性菌株篩選

二醇氧化酶轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物羥基乙酸是一種羧酸，可根據(jù)文獻(xiàn)［10-11］報(bào)道的顯色法測(cè)定。因此，可利用羥肟酸鐵比色法建立二醇氧化酶催化合成羧酸的高通量篩選策略。顯色反應(yīng)是在24孔板中進(jìn)行的，取40μL反應(yīng)上清液加入1 mL 0.070 mol／L的高氯酸羥胺（HAP）和500μL 0.60 mol／L的DCC溶液，然后室溫反應(yīng)15 min再加入700μL的高氯酸鐵溶液混勻。若反應(yīng)液中存在羧酸，則加入顯色劑后立即出現(xiàn)紫紅色，說(shuō)明具有降解二醇合成羧酸的能力。分別以乙二醇和苯乙二醇為唯一C源，利用富集培養(yǎng)技術(shù)［11］從土壤中篩選二醇氧化酶產(chǎn)生菌。經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩后，從960份土壤中篩選獲得一株乙二醇氧化活力較高的菌株CCZU12-1。以5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′和5′-AGGAGG?TGATCCAGCCGCA-3′分別為上下游引物對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，并用16S rDNA序列分析法進(jìn)行同源性比較。測(cè)序序列（1 519 bp）進(jìn)行Blast比對(duì)后，CCZU12-1與Brevibacterium lutescens CF87T（序列號(hào)：AJ488509.2）有99%的相似度。利用MEGA5.1軟件采用N?J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以初步斷定CCZU12-1為短桿菌屬（Brevibacterium sp.），命名該菌株為Brevibacterium sp.CCZU12-1。值得注意的是，這是第一次報(bào)道利用短桿菌屬（Brevibacterium sp.）催化乙二醇進(jìn)行羥基乙酸的合成。

圖1 CCZU12-1菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of CCZU12?1

2.2 Brevibacterium sp.CCZU12-1催化乙二醇反應(yīng)特性初步研究

2.2.1 催化反應(yīng)溫度和pH對(duì)酶活力的影響

反應(yīng)溫度及pH對(duì)催化劑的活性有顯著的影響［2，12］?？疾觳煌磻?yīng)溫度（20～40℃）及反應(yīng)pH（6.0～8.0）對(duì)Brevibacterium sp.CCZU12-1催化氧化乙二醇活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2（a）可知：隨著溫度的升高，催化活性也隨之增大，在30℃時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)提高反應(yīng)溫度，催化活性快速下降。由此可見(jiàn)，最適反應(yīng)溫度為30℃。由圖2（b）可知：在反應(yīng)條件過(guò)酸或過(guò)堿時(shí)，催化活性明顯降低，pH為6.5時(shí)，酶活達(dá)到最大值，由此可見(jiàn)，最適反應(yīng)pH為6.5，催化劑比活力為14.8 U／g。而Su等［13］報(bào)道的Gluconobacter oxydans DSM2003最適反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH分別為28℃和6.0。

2.2.2 金屬離子對(duì)酶活力的影響

圖2 反應(yīng)溫度和pH對(duì)乙二醇酶氧化活性的影響Fig.2 Effects of reaction temperature and reaction pH on ethylene glycol?oxidizing activity

金屬離子對(duì)催化劑的活性是有影響的［4，12］。因此，考察不同金屬離子（CaCl2、CoC12、CuCl2、FeCl2、MgCl2、MnCl2·2H2O、NiCl2·7H2O和ZnCl2等）及其濃度分別為0.1和0.5 mmol／L時(shí)對(duì)酶活活力的影響，并以不加任何金屬離子的空白為對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知：當(dāng)金屬離子的濃度分別為0.1 mmol／L時(shí)，Co2＋、Cu2＋和Ni2＋等對(duì)催化活性具有明顯的抑制，而Ca2＋、Mg2＋、Fe2＋、Zn2＋和Mn2＋等對(duì)催化活性則具有較明顯的促進(jìn)作用。Mn2＋（0.1 mmol／L）的促進(jìn)作用較明顯。當(dāng)金屬離子的濃度分別為0.5 mmol／L時(shí)，Ca2＋、Mg2＋、Fe2＋、Zn2＋和Mn2＋等對(duì)催化活性促進(jìn)作用減弱?？梢?jiàn)，最適的金屬離子添加劑為Mn2＋（0.1 mmol／L）。王嘉樂(lè)等［14］報(bào)道了Ca2＋對(duì)氧化葡萄糖酸桿菌胞內(nèi)脫氫酶Gox0525活性有顯著的促進(jìn)作用，而Mn2＋對(duì)其活性影響不明顯。Malaoui等［15］報(bào)道Mn2＋對(duì)Clostridium butyricum E5突變菌1，3-丙二醇脫氫酶活性有明顯的促進(jìn)作用。Mn2＋可能與Brevibacterium sp.CCZU12-1乙二醇氧化酶活性中心關(guān)鍵殘基相互作用，導(dǎo)致活性提高。

表1 金屬離子對(duì)乙二醇氧化活性的影響Table 1 Effects of variousmetal ions on ethylene glycol?oxidizing activity

2.2.3 底物濃度對(duì)催化反應(yīng)的影響

不同底物濃度對(duì)催化反應(yīng)有影響的［12］?？疾旒尤氩煌牡孜镆叶迹K濃度為50～400 mmol／L，在30℃、160 r／min的恒溫?fù)u床中振蕩反應(yīng)，取樣分析測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知：在底物濃度小于200 mmol／L時(shí)，催化活性隨著底物濃度的增加而加快，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00 mmol／L時(shí)，催化活性達(dá)到最大值，繼續(xù)增大底物濃度，則催化活性減小，可見(jiàn)底物乙二醇對(duì)Brevibacterium sp.CCZU12-1催化有一定的抑制作用。因此，確定最適底物濃度為200 mmol／L時(shí)，催化劑比酶活為18.9 U／g。底物耐受性與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的結(jié)果相似，說(shuō)明Brevibacterium sp.CCZU12-1具有良好的催化氧化乙二醇活性。

圖3 底物濃度對(duì)乙二醇氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of substrate concentration on ethylene glycol?oxidizing activity

2.2.4 CCZU12-1靜息細(xì)胞催化乙二醇的反應(yīng)進(jìn)程

在最適反應(yīng)條件下，考察Brevibacterium sp. CCZU12-1催化氧化乙二醇的反應(yīng)進(jìn)程。稱取1.0 g Brevibacterium sp.CCZU12-1靜息細(xì)胞，加入底物乙二醇于100 mL磷酸鹽緩沖溶液體系（pH 6.5，100 mmol／L），底物終濃度為200 mmol／L，氧化轉(zhuǎn)化反應(yīng)在30℃、160 r／min條件下進(jìn)行，反應(yīng)進(jìn)程如圖4所示。由圖4可知：反應(yīng)4 h內(nèi)，氧化速度較快，4 h羥基乙酸產(chǎn)率為33.7%。12 h后，羥基乙酸產(chǎn)率為70.1%。進(jìn)一步延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到24 h后，羥基乙酸產(chǎn)率達(dá)到94.6%。并且在反應(yīng)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)醛基化合物及其他副產(chǎn)物的生成。而文獻(xiàn)［4］報(bào)道Alcaligenes sp.ECU0401腈水解酶可催化50 mmol／L羥基乙腈合成羥基乙酸，反應(yīng)36 h產(chǎn)率為73.6%。很明顯，利用Brevibacterium sp.CCZU12-1催化合成羥基乙酸具有潛在的應(yīng)用前景。如何提高Brevibacterium sp.CCZU12-1催化活性及羥基乙酸產(chǎn)量的相關(guān)研究仍在進(jìn)行中。

圖4 CCZU12-1靜息細(xì)胞催化乙二醇的反應(yīng)進(jìn)程Fig.4 Time course for the oxidation of ethylene glycol by resting cells of CCZU12?1

2.3 分批補(bǔ)料對(duì)合成羥基乙酸的影響

采用分批補(bǔ)料的方法可以緩解底物的抑制作用［12］。因此，考察分批補(bǔ)料對(duì)CCZU12-1靜息細(xì)胞合成羥基乙酸的影響，每反應(yīng)24 h補(bǔ)料200 mmol／L乙二醇，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知：進(jìn)行補(bǔ)料5批，反應(yīng)至第132 h，產(chǎn)物的累計(jì)濃度為972 mmol／L。生物催化劑時(shí)空產(chǎn)率為0.56 g／（L·h）。

圖5 分批補(bǔ)料進(jìn)行乙二醇催化氧化合成羥基乙酸的反應(yīng)進(jìn)程Fig.5 Time course for oxidation of ethylene glycol to glycolic acid using fed?batch method

3 結(jié) 論

從土壤中篩選獲得1株乙二醇氧酶菌株Brevibacterium sp.CCZU12-1，同時(shí)對(duì)其催化特性進(jìn)行了初步考察，得到最適反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)pH為6.5，金屬離子添加劑為Mn2＋（0.1 mmol／L）。在最適催化反應(yīng)條件下，催化200 mmol／L的乙二醇，羥基乙酸的產(chǎn)率可達(dá)到94.6%。分批補(bǔ)料乙二醇5批（累計(jì)132 h），羥基乙酸的累計(jì)濃度為972 mmol／L。本研究為高效生物氧化乙二醇制備重要中間體羥基乙酸提供了可行途徑，同時(shí)也為生物催化氧化二醇合成具有重要應(yīng)用前景的羥基羧酸類手性中間體提供了理論指導(dǎo)。

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Isolation and catalytic characteristics of ethylene glycol?oxidizing strain

HE Yucai1，2，XU Xiaofeng1，PAN Xuehe1，WU Miaoxin1

（1.Laboratory of Biochemical Engineering，College of Pharmaceutical and Life Sciences，Changzhou University，Changzhou 213164，China；2.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai200237，China）

Brevibacterium sp.CCZU12?1 had been isolated from soil samples with high diol?oxidizing activity against ethylene glycol using the enrichment culture technique.Using the resting cells of Brevibacterium sp.CCZU12?1 as catalysts，the optimal reaction temperature，pH and metal ion additive for diol?oxidizing activity were 30℃，6.5 and Mn2＋（0.1 mmol／L），respectively.After 24 h of biotransformation，the yield of glycolic acid from 200 mmol／L ethylene glycol was 94.6%.Using fed?batch method，a total of 972 mmol／L of glycolic acid had been accumulated in the reaction mixture after the 5th feed.

oxidation；ethylene glycol；glycolic acid；Brevibacterium

Q93；X703

A

1672-3678（2013）06-0029-05

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.006

2013-02-18

國(guó)家自然科學(xué)基金（21102011）；常州市生物醫(yī)藥科技專項(xiàng)（CE20115051）

何玉財(cái)（1979—），男，遼寧開(kāi)原人，副教授，博士，研究方向：生物催化，E?mail：heyucai2001＠163.com