楊梅莉 李 欣

（上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院神經內科，上海 200090）

急性腦梗死患者血清死亡蛋白激酶1（DAPK1）與N-甲基-D-天門冬氨酸鹽（NMDA）受體相關性的研究

楊梅莉 李 欣

（上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院神經內科，上海 200090）

目的 聯合應用抗血小板聚集（拜阿司匹林片）、和（或）抗凝（法安明）、和（或）降脂（辛伐他?。┖停ɑ颍┤芩ǎ╮t-PA）治療急性腦梗死，同時觀察血清死亡蛋白激酶1（death-associated protein kinase1，DAPK1）含量的變化，進一步探討NMDA受體和死亡蛋白激酶（DAPK1）在腦梗死的相互作用，為缺血性腦血管疾病的防治提供臨床依據。方法 選擇發(fā)病在72h以內住院急性腦梗死患者，分為溶栓組11例、常規(guī)治療組56例，并選擇我科因后循環(huán)缺血住院患者46例做為對照組。溶栓組除了給予rt-PA溶栓外，與常規(guī)治療組均聯合應用抗血小板聚集（阿司匹林腸溶片100mgqd）、和（或）抗凝（低分子肝素5000u皮下注射，每日2次）、和（或）降脂（辛伐他汀片20mgqN）及活血化瘀（奧扎格雷鈉40mgqd）、清除自由基（依達拉奉30mg bid）等治療，對照組僅給予常規(guī)的活血化瘀、營養(yǎng)神經等治療，觀察治療前和治療10d后患者的血清死亡蛋白激酶1（DAPK1）含量的變化，以及肝功能、血小板、凝血機制及臨床神經功能缺損評分進行評定，進一步探討NMDA受體和死亡蛋白激酶1（DAPK1）在缺血性腦血管疾病的相互作用機制。結果 溶栓組及常規(guī)治療組患者的死亡蛋白激酶1（DAPK1）含量均高于對照組，治療10天后溶栓組及常規(guī)治療組患者的死亡蛋白激酶1（DAPK1）含量均降低，常規(guī)治療組更明顯（P＜0.05），溶栓組的神經功能缺損評分（NIHSS）明顯降低（P＜0.05），臨床療效明顯優(yōu)于常規(guī)治療組（P＜0.05），肝功能、血小板、凝血功能、血脂的指標均在正常范圍內。結論 死亡蛋白激酶1（DAPK1）通過與NMDA受體的NR2B亞型結合激活神經細胞死亡通路，激發(fā)神經細胞死亡，形成卒中[2]，為缺血性腦血管病的防治提供臨床依據。

急性腦梗死；急性腦梗死患者血清死亡蛋白激酶1（DAPK1）；N-甲基-D-天門冬氨酸鹽（NMDA）受體；相關性研究

急性腦梗死在世界范圍內占腦卒中70%以上，是一類危害人類健康的常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率、患病率、致殘率、病死率均相當高，成為目前第二死亡疾病，我國腦血管疾病的發(fā)病居世界第二位，已構成日益嚴重的醫(yī)學、社會和公共衛(wèi)生問題。

近年來研究發(fā)現一種名為NMDA（N-甲基-D-天門冬氨酸鹽）受體與腦細胞死亡有很大的關聯，與急性缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展密切相關，在腦血管疾病中的作用倍受關注[3]。

已有研究表明死亡蛋白激酶1（death-associated protein kinase1，DAPK1）通過與NMDA受體的NR2B亞型結合激活神經細胞死亡通路，引發(fā)一系列的反應，激發(fā)神經細胞死亡，形成卒中，但其中的機制目前尚不明了。本研究對于我院神經內科于2011年1月至2012年12月67例腦梗死患者及對照46例后循環(huán)缺血患者觀察治療10d前后血清死亡蛋白激酶1（DAPK1）含量的變化，進一步探討NMDA受體和死亡蛋白激酶1（DAPK1）在缺血性腦血管疾病的相互作用，為缺血性腦血管疾病的防治提供臨床依據。

1 資料與方法

1.1 對象

1.1.1 入選標準

①住院患者；②年齡18～80歲；③臨床診斷符合第4屆腦血管病會議的診斷標準，為急性缺血性卒中并引起可評估的神經功能缺損（如語言、運動功能、認知的損害、凝視障礙、視野缺損或/和視覺忽視）。急性缺血性卒中定義為突然發(fā)生的急性的局灶性的神經功能缺損，推測原因為腦缺血，CT除外腦出血；④發(fā)病在72h以內住院；⑤首次發(fā)病或既往卒中未遺留明顯后遺癥（MRS≤2）；⑤卒中癥狀持續(xù)至少30min，治療前無明顯改善。臨床表現必須和全腦缺血（如暈厥）、癲癇或偏頭痛鑒別；⑥經顱腦CT和（或）磁共振成像（MRI）檢查證實有與本次發(fā)病相關的梗死灶。由于早期腦梗死尤其24h內的顱腦CT表現不能反映真實病情，故梗死病灶根據入院后7d內顱腦CT或MRI復查結果。⑦患者同意接受治療，并對病史數據的采集保存和隨訪過程知情同意；⑧愿意并有能力遵循該研究方案。

表4 三組治療前后肝功能的比較

1.1.2 排除標準

①既往卒中遺留明顯后遺癥（MRS＞2）；②昏迷或臨床評估（如NIHSS＞25）和（或）其他的影像學證實為嚴重卒中；③發(fā)病時伴有癲癇發(fā)作；④排除自身免疫性疾病、惡性腫瘤及新近發(fā)生感染性疾病。⑤合并嚴重心、肺、肝、腎功能不全者；⑥已應用抗凝或抗血小板藥物者；⑦血壓超過200/100mmHg；⑧年齡＞80歲。

1.1.3 分組

入選病例113例，分為溶栓組11例、常規(guī)治療組56例、對照組46例。其中溶栓組11例（男7例，女4例），年齡43～75歲，平均年齡61歲；伴高血壓10例。常規(guī)治療組56例（男42例，女14例），年齡40～80歲，平均年齡64.03歲；伴高血壓31例。對照組46例（男19例，女27例），年齡47～80歲，平均年齡64.86歲；伴高血壓20例；三組之間性別、年齡、伴發(fā)高血壓情況及病情輕重經統計學檢驗無顯著差異（P＞0.05）。

1.2 治療方法

1.2.1 三組均常規(guī)給予控制血壓、血糖及血脂，顱內高壓者給予脫水降顱壓（甘露醇）治療。

1.2.2 溶栓組

除了給予rt-PA溶栓外，聯合應用抗血小板聚集（阿司匹林腸溶片100mgqd）、和（或）抗凝（低分子肝素5000u皮下注射，每日2次）、和（或）降脂（辛伐他汀片20mg qN）及活血化瘀（奧扎格雷鈉40mg qd）、清除自由基（依達拉奉30mg bid）等治療。

1.2.3 常規(guī)治療組

聯合應用抗血小板聚集（阿司匹林腸溶片100mgqd）、和（或）抗凝（低分子肝素5000u皮下注射，每日2次）、和（或）降脂（辛伐他汀片20mg qN）及活血化瘀（奧扎格雷鈉40mg qd）、清除自由基（依達拉奉30mg bid）等治療。

1.2.4 對照組

僅給予常規(guī)的活血化瘀（奧扎格雷鈉40mg qd）、營養(yǎng)神經（胞二磷膽堿0.5g qd）等治療。

1.3 觀察指標

①觀察治療前和治療10d后患者的血清死亡蛋白激酶1（DAPK1）含量的變化；②觀察治療前后的臨床神經功能缺損評分進行評定；③治療前、治療后10d檢查血常規(guī)、凝血功能及肝功能；

1.4 統計學方法

采用SPSS 12.0 軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較計量資料用t檢驗和χ2檢驗。

2 結 果

2.1 三組治療前后患者的血清死亡蛋白激酶1（DAPK1）含量的變化

溶栓組及常規(guī)治療組患者的死亡蛋白激酶1（DAPK1）含量均高于對照組，治療10d后溶栓組及常規(guī)治療組患者的死亡蛋白激酶1（DAPK1）含量均降低。見表1。

表1 三組治療前后患者的血清死亡蛋白激酶1（DAPK1）含量的變化（ng/L）

2.2 二組治療前后神經功能缺損評分比較

二組患者入院治療前NIHSS評分比較無顯著性差異（P＞0.05），治療10d后二組患者神經功能缺損評分均改善，溶栓組與常規(guī)治療組比較有顯著性差異（P＜0.05）。見表2。

表2 二組治療前后神經功能缺損評分（NIHSS）比較

2.3 三組治療后凝血功能的比較

比較三組治療后凝血功能，可見溶栓組和常規(guī)治療組不影響凝血酶原時間及部分凝血酶原時間，三組患者治療后凝血酶原時間及部分凝血酶原時間、纖維蛋白酶與治療前相比無明顯變化（P＞0.05），見表3。

表3 三組治療前后凝血功能的比較

2.4 三組治療前后肝功能的比較

三組患者入院治療前及治療10d后各組間肝功能各項指標無顯著性差異（P＞0.05），三組患者治療后肝功能各項指標與治療前相比無明顯變化。見表4。

2.5 三組治療前后血小板的比較

抗凝組及聯合組治療前后不影響血小板計數，三組患者治療后血小板計數與治療前相比無明顯變化（P＞0.05）。見表5。

表5 三組治療前后血小板（109/L）的比較

3 討 論

缺血性腦血管病是威脅人類健康的一大殺手，往往無法事先預防，事后也無相對有效的治療辦法，作為全球死亡率和致殘率較高的疾病，全世界的科學家都在為之努力。近年來研究發(fā)現一種名為NMDA（N-甲基-D-天門冬氨酸鹽）受體與腦細胞死亡有很大的關聯，與急性缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展密切相關，在腦血管疾病中起重要的作用。

谷氨酸（glutamate，Glu）是哺乳動物中樞神經系統內重要的興奮性神經遞質，也是腦內含量最高的氨基酸，以大腦皮層和海馬含量最高，Glu是不能通過血腦屏障，不通過血液供給腦，因此只能有局部代謝產生。即葡萄糖經Krabs循環(huán)產生α-酮戊二酸和草酰乙酸，通過轉氨酶作用產生Glu[4]。突觸間隙中的Glu被位于神經元細胞和膠質細胞膜上Na+依賴性EAA轉運體（EAA transporters，EAAT）攝回而被迅速清除使其作用終止。被攝回的Glu被谷氨酰胺（Gln）合成酶的作用下轉變?yōu)镚ln后重新進入突觸前神經元末梢，被線粒體內磷酸化激活的谷氨酸酶轉化成Glu進行再循環(huán)，這就是所謂的“谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)”。正常情況下，Glu在谷氨酸能神經元內被攝入、聚集、貯存于囊泡內，當神經元去極化時，囊泡內的Glu以Ca2+依賴方式釋放于突觸間隙中，與突觸后不同亞型的Glu受體結合。完成興奮性突觸傳遞及其他生理作用。靜息狀態(tài)下，Glu在細胞外、細胞內、突觸囊胞內的濃度分別為1μm、10μm及100μm。病理情況下，細胞外間隙中Glu濃度增高，過度剌激其受體對中樞神經系統有明顯的毒性作用即興奮性神經毒性。

谷氨酸受體（glutamate receptor，GluR）分為5種，包括4種親離子即N-甲基D-門冬氨酸（N-methy-D-aspatrate，NMDA）受體，α-氨基-3-羥基5-甲基-4-異惡唑丙酸（α-mino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazole propionic acid，AMPA）受體，海人藻酸（kanic acid，KA）受體和 L-2-氨基4-磷丁酸（L-AP4）受體及一種親代謝型受體，后四種又稱為非NMDA受體。Glu與突觸后親離子受體結合，導致陽離子通道打開，使膜去極度化，膜興奮性增高，興奮性突觸后電位主要有AMPA和NMDA受體介導的成份組成。L-AP4受體可能位于興奮性突觸前膜，對Glu釋放起負反饋作用。親代謝受體與G-蛋白相耦聯可能參與磷酸肌醇的代謝、花生四烯酸的生成和環(huán)-磷酸肌苷的調節(jié)，其功能尚不完全清楚[5]。

N-甲基-D-天冬氨酸（N-Methyl-D-Aspartate，NMDA）受體是離子型谷氨酸受體，在哺乳動物腦組織中廣泛存在，NMDA受體的激活在許多疾病的發(fā)病機制中起著重要的作用，尤其是缺血性腦血管病。NMDA受體是目前研究較為深入的EAAs受體之一。哺乳動物中樞神經系統內NMDA受體從大腦皮層到脊髓都有廣泛分布，其中以大腦皮層和海馬密度最高。利用分子生物學技術現已發(fā)現NMDA受體至少存在7種亞型，即NR1、NR2A、NR2B、NR2C、NR2D、NR3A和NR3B。NR1是功能亞基，與NR2、NR3亞基組成異聚體后，能形成有高度功能活性的NMDA受體通道。NMDA受體除具有Glu連結位點外，還有甘氨酸連結位點，必須兩個位點都結合后，才能激活受體。

NMDA受體有兩個顯著區(qū)別于其他谷氨酸受體的特性。①具有電壓依賴的Mg2+離子阻斷作用，即當膜電位高于-40mV時，這種Mg2+對NDNA受體的阻斷作用消失；②NDNA受體不僅對單價離子Na+、K+有通透性，而且對Ca2+具有高通透性，NMDA受體參與了許多復雜的生理和病理機制，如誘導長時程增強作用（long-term potentiation，LTP）（因而與學習和記憶機制相關）、控制著發(fā)育過程大腦神經元回路（brain circuitry）的結構和突觸的可塑性、缺血缺氧導致的興奮性毒性作用、癲癇的形成以及神經退行性變[6]。

NMDA受體具有兩大類功能，①生理功能：涉及記憶與學習等多種高級腦部活動功能；②病理功能：當NMDA病理通路被激活時，會促使神經細胞死亡，導致腦部功能異常，也產生常見的神經退行性疾病[7]，如卒中、帕金森氏癥、精神分裂癥。

NMDA受體通道具有一種獨特的門控方式，既受配基門控，又受電壓門控，其電壓依賴性是離子通道內部的Mg阻滯作用決定的[8]。與非NMPA受體不同，NMDA受體激動時，其偶聯的陽離子通道開放，除Na+、K+通過外，還允許Ca2+通過。高鈣電導是NMDA受體的特點之一，也是NMDA受體與Glu興奮性神經毒性、觸發(fā)突觸長時程增強（long-term potentiation，LTP）效應、學習記憶形成機制密切相關的原因。顱內興奮性遞質谷氨酸及NMDA受體被認為與學習、記憶、中樞神經系統疼痛的傳導和大腦創(chuàng)傷后神經元的死亡等有重要關系[9]。

NMDA受體是神經科學中十分熱門的課題，可是多年來，國內外學者一直沒有破解NMDA受體的病理通路機制。沒有找到原因，無法開發(fā)有效的藥物和設計有效的治療方案。最近研究表明死亡蛋白激酶1（death-associated protein kinase1，DAPK1）通過與NMDA受體的NR2B亞型結合激活神經細胞死亡通路，引發(fā)一系列的反應，激發(fā)神經細胞死亡，形成卒中。尤為關鍵的是，DAPK1僅介導NMDA的病理功能，并不影響NMDA的正常生理功能[10]。

動物試驗證明，NMDA受體拮抗劑能阻斷LTP形成，并損害小鼠空間辨別記憶。在動物試驗中，將DAPK1基因敲除后，試驗鼠的正常神經功能不受影響，在出現腦缺血缺氧的情況下，由于缺乏DAPK1而無法激活NMDA病理通路，有效地保護了試驗鼠的神經元。

綜上所述，神經元凋亡部分是由于通過谷氨酸受體通路流入了過量的鈣。死亡蛋白激酶1（DAPK-1）的激活對這一鈣流入途徑起到了促進作用，兩者共同促進了腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。本研究中溶栓組及常規(guī)治療組患者的死亡蛋白激酶1（DAPK1）含量均高于對照組，治療10d后溶栓組及常規(guī)治療組患者的死亡蛋白激酶1（DAPK1）含量均降低，常規(guī)治療組更明顯（P＜0.05），溶栓組的神經功能缺損評分（NIHSS）明顯降低（P＜0.05），臨床療效明顯優(yōu)于常規(guī)治療組（P＜0.05），肝功能、血小板、凝血功能、血脂的指標均在正常范圍內。這一結果符合理論依據，為缺血性腦血管病的防治提供臨床依據。

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[5] Moriyoshi K,Masu M,Ishii T,et al.Molecular neurobiology. NMDA receptors cloned at last[J].Nature,1991,354(6348):31.

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Correlational Study of the Serum Levels of DAPK1 and NMDA Receptor in Acute Cerebral Infarction Patients

YANG Mei-li, LI Xin
(Department of Internal Medicine-Neurology, Shanghai Yangpu District Central Hospital, Shanghai 200090, China)

Objective To investigate changes in the serum level of DAPK1 and its interaction with NMDA receptor in acute cerebral infraction patients, who were treated combined with the anti-platelet aggregation(Aspirin tablets), and/or anticoagulant(Fragmin), and/or lipid-lowering(simvastatin) and/or thrombolysis(rt-PA). Aim to provide clinical evidence for the prevention and treatment of ischemic cerebrovascular disease. Methods 67 patients hospitalized for acute cerebral infarction in 72 hours, were divided into two groups:11 cases with thrombolysis treatment and 56 cases with conventional treatment.46 cases with posterior circulation ischemic were selected as control group. Conventional treatment group was given anti-platelet aggregation(aspirin tablets 100 mg qd), and/or anticoagulation(heparin 5000u subcutaneous injection, bid), anti-oxidant(edaravone 30mg bid), and/or lipid-lowering(simvastatin tablets 20mg qn)and blood stasis transforming(ozagrel 40mg qd) treatment. Rt-PA was added in thrombolysis treatment group and the control group was given conventional blood stasis transforming and nerve nutrition treatments. The serum level of DAPK1, liver function, platelet, coagulation and NIHSS were measured before and after 10-day therapy respectively. The interaction mechanism of NMDA receptor and DAPK1 in ischemic cerebrovascular disease was further explored. Results The serum levels of DAPK1 in the thrombolysis treatment group and the conventional treatment group was higher than the ones in the control group. The serum levels of DAPK1 was lower in the thrombolysis treatment group and the conventional treatment group 10 days later, especially in conventional treatment group(P＜0.05); NIHSS was significantly reduced in thrombolysis group(P＜0.05). Liver function, platelet, coagulation, blood lipids were within the normal range. Conclusions The interaction of DAPK1 and NR2B subtype of NMDA receptor may activate the pathways of neuronal cell death and induced stroke.Our study will provide the clinical basis for the prevention and treatment of ischemic cerebrovascular disease.

Acute cerebral infarctio; Death-associated protein kinase1; N-methy-D-aspatrate Receptor;correlational study

R743.3

B

1671-8194（2013）35-0015-04