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        高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定人參制劑中20 種人參皂苷方法的建立

        2016-12-06 09:11:08楊艷文孟凡雙郜玉鋼張連學(xué)
        食品科學(xué) 2016年22期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)

        楊艷文,孟凡雙,郜玉鋼*,張連學(xué)*

        (吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118)

        高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定人參制劑中20 種人參皂苷方法的建立

        楊艷文,孟凡雙,郜玉鋼*,張連學(xué)*

        (吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118)

        為了更加有效評(píng)價(jià)人參制劑生產(chǎn)質(zhì)量,建立了一種同時(shí)測(cè)定人參制劑中20 種人參皂苷的高效液相色譜方法。結(jié)果表明,20 種人參皂苷Rg1、Re、Rg2、Rg3、Rg5、Rf、F1、F2、Rc、Rd、Rb1、Rb2、Rb3、Rh2、compound K、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4、原人參二醇及原人參三醇均得到良好分離,線性關(guān)系良好(R≥0.999 2)。該方法快捷簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠,能夠精確全面檢測(cè)分析人參皂苷含量,對(duì)于人參加工品及其制劑的質(zhì)量控制更為全面準(zhǔn)確可行。

        人參;人參皂苷;高效液相色譜;含量測(cè)定

        人參皂苷是人參、西洋參及人參制劑中的主要活性成分[1-8],主要包括人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2等[9-10],對(duì)皂苷類成分的質(zhì)量控制,是人參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的核心內(nèi)容。針對(duì)人參皂苷含量測(cè)定方法的研究報(bào)道比較多,如郜玉鋼[11]、胥秀英[12]、劉志[13]、郭沖[14]、Wang Hongping[15]等分別報(bào)道了用高效液相色譜法測(cè)定人參及其制劑中9、12、14、16 種和19 種人參皂苷含量方法,但至今鮮見有用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定人參制劑中20 種人參皂苷的報(bào)道。人參樣品在加工炮制過程中,人參皂苷受溫度、酸堿度的影響,會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化,形成稀有人參皂苷[16];對(duì)于人參制劑,由于中藥制劑處方復(fù)雜,在制備過程中,皂苷類物質(zhì)則更容易發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化形成次級(jí)皂苷[17-18]。因此,僅對(duì)人參炮制加工品及人參制劑所含的常見主要人參皂苷進(jìn)行含量測(cè)定來控制產(chǎn)品質(zhì)

        量顯然是不夠的[19],本實(shí)驗(yàn)建立了用高效液相色譜-紫外檢測(cè)方法同時(shí)測(cè)定包括常見主要人參皂苷、稀有皂苷在內(nèi)的20 種人參皂苷(苷元)含量的方法,以求對(duì)人參加工品及其制劑的質(zhì)量控制提供強(qiáng)有力的理論支持。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        人參生曬參;西洋參生曬參;生脈飲(生產(chǎn)批號(hào)1407001) 吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司;人參健脾丸(生產(chǎn)批號(hào)4015661) 中國(guó)北京同仁堂(集團(tuán))有限責(zé)任公司。

        人參皂苷對(duì)照品Rg1、Re、Rg2、Rg3、Rg5、Rf、F1、F2、Rc、Rd、Rb1、Rb2、Rb3、Rh2、compound K、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4、原人參二醇及原人參三醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在98%以上,批號(hào)分別為(201511、201523、201545、201506、201524、201537、201549、201521、201536、201579、201501、201551、201518、201543、201520、201515、201562、201571、201519、201513) 吉林大學(xué)天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室;甲醇、乙腈(均為色譜純) 德國(guó)默克公司;純凈水 杭州娃哈哈公司;其余試劑為分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        LC-2010A高效液相色譜儀(配有LC-2010A型液相色譜泵、LC-2010A型自動(dòng)進(jìn)樣器、BDS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱、CLASS-vP色譜工作站)、AUY22電子分析天平 日本島津公司;Anke TGL-16B型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;KQ-250DV超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 溶液配制

        1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液

        分別精密稱取20 種人參皂苷Rg1、Re、Rg2、Rg3、Rg5、Rf、F1、F2、Rc、Rd、Rb1、Rb2、Rb3、Rh2、compound K、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4、原人參二醇及原人參三醇對(duì)照品各5 mg,加甲醇配制成上述20 種人參皂苷的質(zhì)量濃度分別為1.04、1.02、0.98、1.00、1.00、1.02、1.00、1.00、1.00、1.02、1.00、1.00、1.04、1.00、1.00、0.98、1.00、1.00、1.00、1.02 mg/mL的對(duì)照品溶液,經(jīng)0.45 μm濾膜濾過,備用。

        1.3.1.2 樣品溶液

        精密稱取人參生曬參粉末1 g,加5 mL色譜甲醇,密封,超聲提取45 min,靜置過夜,再超聲45 min,離心,取上清液,用0.45 μm濾膜濾過,備用。精密稱取西洋參生曬參粉末1 g,加5 mL色譜甲醇,密封,超聲提取45 min,靜置過夜,再超聲45 min,離心,取上清液,用0.45 μm濾膜濾過,備用。取生脈飲口服液,用0.45 μm濾膜濾過,備用。精密稱取人參健脾丸大蜜丸1 丸(6 g),加10 mL色譜甲醇,超聲提取45 min,過夜,再超聲45 min,補(bǔ)足體積,混勻,靜置,取上清液,離心,經(jīng)0.45 μm濾膜濾過,備用。

        1.3.2 色譜條件

        色譜柱為C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫35 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm,流動(dòng)相乙腈(A)-水(B)梯度洗脫(0~40 min,18%~21% A;40~42 min,21%~26% A;42~46 min,26%~32% A;46~66 min,32%~33.8% A;66~71 min,33.8%~38% A;71~77.7 min,38%~49.08 A;77.7~78 min,49.08%~49.1% A;78~82 min,49.1% A;82~83 min,49.1%~50.6% A;83~88 min,50.6%~59.6% A;88~89.8 min,59.6%~64.96% A;89.8~92 min,64.96%~65% A;92~97 min,65% A;97~102 min,65%~85% A;102~109 min,85% A;109~111 min,85%~18% A);流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量20 μL。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 色譜條件的優(yōu)化

        本實(shí)驗(yàn)以甲醇為空白對(duì)照,對(duì)照品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(190~400 nm),結(jié)果人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、20(R)-Rh1、Rb2、Rb3、F1、Rd、Rk3、F2、Rh4、Rg3、原人參三醇、compound K、Rg5、Rh2、原人參二醇對(duì)照品在203 nm處均有最大吸收,故選擇該波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。比較了20 種人參皂苷在不同色譜柱(Nucleosil C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)、Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm,5 μm)、BDS C18(4.6 mm×l50 mm,5 μm))中的分離效果,結(jié)果表明BDS C18柱分離效果好,保留時(shí)間適中;在流動(dòng)相的選擇過程中,分別考察了甲醇-水、乙腈-水梯度洗脫等不同洗脫系統(tǒng),結(jié)果表明乙腈-水梯度洗脫時(shí)20 種人參皂苷分離度好,故選擇乙腈-水梯度洗脫為流動(dòng)相。本實(shí)驗(yàn)還考察了不同洗脫流速的影響,結(jié)果表明當(dāng)流速為1 mL/min時(shí)分離效果最好。

        2.2 色譜峰歸屬

        按1.3.2節(jié)色譜條件,對(duì)照品與樣品高效液相色譜圖,如圖1所示。

        圖1 混標(biāo)和樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution of ginsenosides and samples

        2.3 線性關(guān)系考察

        由圖1可知,20 種人參皂苷得到良好地分離,按1.3.1節(jié)方法制備對(duì)照品溶液,分別精密吸取對(duì)照品溶液2、4、8、12、16、18、20 μL進(jìn)行進(jìn)樣,以進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品溶液中人參皂苷的質(zhì)量(Y)對(duì)峰面積積分值(X)作圖,繪制20 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出20 個(gè)線性回歸方程,得到相關(guān)系數(shù)r≥0.999 2,且呈良好的線性關(guān)系,見表1。

        表1 人參皂苷的回歸方程Table1 Regression equations with correlation coefficients for ginsenosides

        2.4 檢測(cè)限與定量限測(cè)定結(jié)果

        在選定的色譜條件下,當(dāng)信噪比為3時(shí),測(cè)得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、20(R)-Rh1、Rb2、Rb3、F1、Rd、Rk3、F2、Rh4、Rg3、原人參三醇、compound K、Rg5、Rh2、原人參二醇的檢測(cè)限分別為0.25、0.15、0.10、0.20、0.10、0.28、0.25、0.31、0.25、0.29、0.31、0.24、0.31、0.10、0.079、0.20、0.21、0.11、0.32、0.21 μg;當(dāng)信噪比為10時(shí),測(cè)得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、20(R)-Rh1、Rb2、Rb3、F1、Rd、Rk3、F2、Rh4、Rg3、原人參三醇、compound K、Rg5、Rh2、原人參二醇的定量限分別為0.70、0.40、0.23、0.23、0.65、0.71、0.78、0.82、0.71、0.72、0.67、0.76、0.70、0.35、0.155、0.65、0.48、0.64、0.71、0.82 μg。

        2.5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        按照2.1節(jié)優(yōu)化的色譜條件,精密吸取對(duì)照品溶液20 μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、20(R)-Rh1、Rb2、Rb3、F1、Rd、Rk3、F2、Rh4、Rg3、原人參三醇、compound K、Rg5、Rh2、原人參二醇峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.21%、1.13%、1.31%、0.63%、1.56%、1.25%、0.76%、1.05%、0.88%、0.98%、0.65%、1.16%、0.98%、1.26%、0.81%、0.69%、1.29%、1.58%、1.05%、0.86%,結(jié)果表明儀器的精密度良好。

        2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        精密吸取人參健脾丸樣品溶液,按1.3.2節(jié)色譜條件,在0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣20 μL,人參健脾丸

        中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、20(R)-Rh1、Rb2、Rb3、F1、Rd、Rh4、Rg3、原人參三醇、compound K、Rg5、Rh2、原人參二醇峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.39%、1.72%、1.63%、1.76%、1.56%、1.98%、1.27%、1.79%、1.52%、1.48%、1.38%、1.87%、1.54%、2.01%、1.35%、1.67%、1.83%、1.41%,說明人參健脾丸溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        精密稱取6 份同一廠家同一批號(hào)人參健脾丸,按供試品溶液制備方法制得供試品溶液,按1.3.2節(jié)色譜條件,分別進(jìn)樣20 μL,進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn),人參健脾丸中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、20(R)-Rh1、Rb2、Rb3、F1、Rd、Rh4、Rg3、原人參三醇、compound K、Rg5、Rh2、原人參二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.88%、1.51%、1.35%、1.56%、1.75%、2.16%、2.39%、1.58%、1.83%、0.54%、1.26%、2.34%、0.31%、1.82%、0.18%、2.57%、1.07%、2.58%。

        2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        精密稱取3 份已知人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、20(R)-Rh1、Rb2、Rb3、F1、Rd、Rh4、Rg3、原人參三醇、compound K、Rg5、Rh2、原人參二醇含量(0.522 8、0.472 4、0.019 23、0.328 4、0.302 1、0.201 3、0.328 4、0.164 3、0.233 4、1.134 6、0.123 5、0.043 5、0.204 2、3.427 8、0.468 6、0.542 3、1.426 7、1.673 8%)的同一廠家同一批號(hào)人參健脾丸1丸,分別精確加入人參皂苷對(duì)照品Rg1(0.16、0.30、0.63 mg)、Re(0.13、0.25、0.54 mg)、Rf(0.007、0.012、0.025 mg)、Rb1(0.10、0.17、0.45 mg)、Rg2(0.08、0.16、0.34 mg)、Rc(0.06、0.11、0.25 mg)、20 (R)-Rh1(0.10、0.18、0.38 mg)、Rb2(0.06、0.10、0.24 mg)、Rb3(0.11、0.19、0.41 mg)、F1(0.40、0.68、1.32 mg)、Rd(0.042、0.07、0.16 mg)、Rh4(0.01、0.02、0.05 mg)、Rg3(0.07、0.15、0.34 mg)、原人參三醇(0.96、1.73、3.45 mg)、compound K(0.17、0.30、0.65 mg)、Rg5(0.15、0.28、0.60 mg)、Rh2(0.33、0.79、1.51 mg)、原人參二醇(0.51、0.89、1.73 mg),按供試品溶液的制備方法制備,按1.3.2節(jié)色譜條件測(cè)定,進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn),人參健脾丸中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、20(R)-Rh1、Rb2、Rb3、F1、Rd、Rh4、Rg3、原人參三醇、compound K、Rg5、Rh2、原人參二醇的平均回收率(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)分別為100.60%(1.21%)、102.42%(0.73%)、100.31%(1.52%)、99.47% (1.48%)、97.13%(1.59%)、102.03%(1.07%)、100.63%(0.79%)、101.57%(1.22%)、98.97% (0.92%)、100.79%(0.95%)、101.00%(1.49%)、97.33%(1.09%)、99.56%(0.98%)、99.91% (0.59%)、100.63%(0.85%)、98.91%(1.22%)、99.03%(1.42%)、100.69%(0.93%)。

        2.9 樣品測(cè)定結(jié)果

        精密稱取人參生曬參、西洋參生曬參、生脈飲、人參健脾丸按供試品溶液的制備方法制備出樣品溶液,按1.3.2節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析,根據(jù)上述線性回歸方程計(jì)算樣品中20 種人參皂苷的含量,見表2。

        表2 人參及其制劑中20 種人參皂苷含量Table2 Contents of 20 ginsenosides in ginseng and ginseng preparations

        表2表明,人參生曬參中,以人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rh4為主,少量存在的稀有皂苷Rh2可能是生曬參加工過程中產(chǎn)生的,未檢測(cè)到人參皂苷20(R)-Rh1、F1、Rk3、F2、Rg3、原人參三醇、compound K、Rg5和原人參二醇。西洋參中以人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rh2為主,還存在少量的Rg2、Rh4、Rg5,未檢測(cè)到人參皂苷Rf、20(R)-Rh1、F1、Rk3、F2、Rg3、原人參三醇、compound K和原人參二醇。生脈飲中含有大量的人參皂苷Rg1,另外還含有少量的Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rh4、原人參三醇,未檢測(cè)到人參皂苷Rf、Rg2、20 (R)-Rh1、Rb3、F1、Rk3、Rg3、compound K、Rg5、Rh2、原人參二醇。人參健脾丸中含有大量的原人參二醇、原人參三醇和人參皂苷Rh2、F1,還含有人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、20(R)-Rh1、Rb2、Rb3、Rd、Rh4、Rg3、compound K、Rg5,未檢測(cè)到人

        參皂苷Rk3、F2。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見人參生曬參、西洋參生曬參、生脈飲和人參歸脾丸所含人參皂苷(苷元)無論是在組成,還是在含量方面都有著很大的差別,即使生脈飲和人參歸脾丸是由人參生曬參入藥制成,但這兩種制劑與人參生曬參及兩種制劑之間在人參皂苷組成和含量方面都有著很大的差異,這也說明人參中所含的人參皂苷類成分在人參制劑制備過程中受制備工藝及制劑處方中其他藥材的影響,皂苷的結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)化,致使人參皂苷的組成及含量發(fā)生了顯著地變化[20]。

        3 討 論

        人參、西洋參是大宗藥材,除了以簡(jiǎn)單加工形成生曬參、紅參等加工品銷售使用外,更主要的是以原料的形式參與到中成藥的制備中。人參的加工品在加工炮制過程中,人參皂苷受溫度、酸堿度的影響,會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化,形成稀有人參皂苷[21],不同的加工工藝,皂苷轉(zhuǎn)化程度和種類都會(huì)有很大差異[22-24];對(duì)于人參制劑,由于中藥制劑處方非常復(fù)雜,在制劑制備過程中,皂苷類物質(zhì)則更容易受到其他中藥材化學(xué)成分的影響而發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化形成次級(jí)皂苷。在樣品測(cè)定部分,有的樣品中未檢測(cè)出該種人參皂苷,是樣品中該種人參皂苷含量過低,低于定量限,所以未檢測(cè)到。

        本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器,其具有造價(jià)低、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn);流動(dòng)相僅為乙腈和水,操作方便,并且解決了磷酸鹽對(duì)色譜柱損耗大,系統(tǒng)清洗麻煩等問題;所用C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5μm)為普通色譜柱,便于購(gòu)買。

        本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫程序,建立了一種同時(shí)測(cè)定人參制劑中20 種人參皂苷含量的分析方法,提高了效率;方法學(xué)考察表明,精密度、最低檢測(cè)限、加樣回收率的范圍均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),20 種人參皂苷分離完全,線性關(guān)系良好,所建立的方法快速簡(jiǎn)便,準(zhǔn)確性、重復(fù)性好,穩(wěn)定可靠。

        采用本實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)的人參生曬參、西洋參生曬參、生脈飲、人參歸脾丸人參皂苷組成及含量結(jié)果也充分說明了人參中所含的人參皂苷類成分在人參制劑制備過程中受制備工藝及制劑處方中其他藥材的影響,皂苷的結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)化,致使人參皂苷的組成及含量發(fā)生了顯著地變化[25]。因此,本實(shí)驗(yàn)建立的采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)方法同時(shí)測(cè)定包括常見主要人參皂苷、稀有皂苷在內(nèi)的20 種人參皂苷(苷元)含量的方法,本方法還檢測(cè)到人參莖葉特有皂苷F1和F2,可鑒別人參產(chǎn)品中是否摻入人參莖葉,這對(duì)于人參加工品及其制劑的質(zhì)量控制相對(duì)于現(xiàn)有的人參皂苷含量測(cè)定法更為全面準(zhǔn)確可行。

        [1] 黎陽, 張鐵軍, 劉素香, 等. 人參化學(xué)成分和藥理研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2009, 40(1): 164-166. DOI:10.3321/j.issn:0253-2670.2009.01.049.

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        Simultaneous Determination of Twenty Ginsenosides in Ginseng Preparations by HPLC

        YANG Yanwen, MENG Fanshuang, GAO Yugang*, ZHANG Lianxue*
        (College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

        In order to evaluate the quality of ginseng preparations, a simple and accurate HPLC method for determining the contents of twenty ginsenosides was established. The results suggested that twenty ginsenosides (ginsenoside Rg1, Re, Rf, Rb1, Rg2, Rc, 20(R)-Rh1, Rb2, Rb3, F1, Rd, Rk3, F2, Rh4, Rg3, protopanaxatriol, compound K, Rg5, Rh2 and protopanaxadiol) were separated at baseline with good linearity (R ≥ 0.999 2). The method is simple, fast, accurate, and could be applied in the quality control of ginseng preparations.

        Panax ginseng; ginsenoside; HPLC; determination

        10.7506/spkx1002-6630-201622019

        R917

        A

        1002-6630(2016)22-0131-05

        楊艷文, 孟凡雙, 郜玉鋼, 等. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定人參制劑中20 種人參皂苷方法的建立[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(22): 131-135. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622019. http://www.spkx.net.cn

        YANG Yanwen, MENG Fanshuang, GAO Yugang, et al. Simultaneous determination of twenty ginsenosides in ginseng preparations by HPLC[J]. Food Science, 2016, 37(22): 131-135. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622019. http://www.spkx.net.cn

        2016-04-07

        國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFC0500303);國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303111);

        吉林省基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(20130102075JC);吉林省重點(diǎn)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(20160307005YY;20140311050YY;20140307012YY)

        楊艷文(1979—),男,講師,博士,研究方向?yàn)樗幱弥参镌耘嗯c加工。E-mail:yanwen_79@163.com

        *通信作者:郜玉鋼(1969—),男,教授,博士,研究方向?yàn)樯帉W(xué)。E-mail:gaoyugang_2006@163.com

        張連學(xué)(1955—),男,教授,博士,研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。E-mail:zlx863@163.com

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