趙杰文, 黃曉瑋, 鄒小波, 黃 林, 石吉勇

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

中國(guó)是豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)的大國(guó)，隨著人民生活水平的提高，對(duì)豬肉品質(zhì)的要求也越來(lái)越高，因而快速無(wú)損地檢測(cè)豬肉變質(zhì)情況顯得尤為重要.豬肉變質(zhì)的一個(gè)主要原因是優(yōu)勢(shì)腐敗菌利用豬肉中的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行自身代謝，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物如硫化物、胺類等，變質(zhì)過(guò)程中伴隨著豬肉氣味和pH值的變化.因此，可以通過(guò)微生物計(jì)數(shù)來(lái)判斷豬肉的新鮮度，目前常用的方法仍是GC/MS、HPLC、微生物培養(yǎng)等方法，這些方法能夠準(zhǔn)確檢測(cè)豬肉的品質(zhì)，但檢測(cè)成本高，動(dòng)用的儀器昂貴且耗時(shí)耗力，檢測(cè)周期長(zhǎng)，不能做到新鮮度的及時(shí)判斷[1-8].因此，尋找一種簡(jiǎn)便快速，并且在人工嗅覺(jué)及味覺(jué)尚不能感知豬肉開(kāi)始變質(zhì)的初期就能做出判斷的新檢測(cè)手段，對(duì)保證肉類食品安全有重要的意義[9-10].

嗅覺(jué)可視化技術(shù)是一種氣體成像的新技術(shù)，屬人工嗅覺(jué)模擬技術(shù)的一個(gè)新分支.嗅覺(jué)可視化技術(shù)利用氣敏化合物(金屬卟啉、原卟啉和pH指示劑)做顯色劑，與受測(cè)物質(zhì)揮發(fā)性氣體進(jìn)行顯色反應(yīng)，通過(guò)顯色劑的顯色狀況，判斷氣體的濃度變化.嗅覺(jué)可視化技術(shù)有以下特點(diǎn):1)將嗅覺(jué)信息轉(zhuǎn)化為視覺(jué)(圖像)信息，使氣味“看得見(jiàn)”，相對(duì)于傳統(tǒng)的電子鼻技術(shù)，嗅覺(jué)成像更加直觀、生動(dòng)[11-17];2)氣味的圖像信息可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為數(shù)值信息，有利于數(shù)學(xué)建模、量化分析及信息的通訊傳遞;3)大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，降低了檢測(cè)成本.本研究以豬肉為研究對(duì)象，用卟啉和pH指示劑制作可視化傳感器陣列，通過(guò)特定顏色圖像的數(shù)值化表達(dá)，檢測(cè)-16℃冷凍、4℃冷藏和20℃室溫3種不同貯藏溫度下，3種優(yōu)勢(shì)致腐菌梭狀芽孢桿菌、熱死環(huán)絲菌、假單胞菌對(duì)豬肉新鮮度的影響.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)中使用的豬肉為屠宰1～2 h后的新鮮豬里脊肉，購(gòu)于菜市場(chǎng).梭狀芽孢桿菌、熱死環(huán)絲菌及假單胞菌屬菌種為實(shí)驗(yàn)室分離鑒定后保存的菌種;滅菌后的生理鹽水、PCA培養(yǎng)基(plate count agar).

主要設(shè)備包括:YM50型壓力蒸汽滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司;JNOEC XS-212-202型生物顯微鏡，四川賽普瑞斯儀器有限公司;LRH-150型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司.

1.2 豬肉樣本的制備

1.2.1 優(yōu)勢(shì)腐敗菌菌液的制備

利用微生物分離的方法獲得寄附于豬肉上的三種優(yōu)勢(shì)致腐菌:梭狀芽孢桿菌、熱死環(huán)絲菌、假單胞菌，采用平板劃線法將菌株置于20～24℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，得到三種優(yōu)勢(shì)腐敗菌苔.將三種菌苔分別接種于500 mL的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，將三種菌液均稀釋至濃度為104CFU/mL備用.

1.2.2 染菌肉塊的制備

將豬里脊肉分割成360小塊，每塊10 g左右，并將小塊豬肉進(jìn)行表面滅菌.經(jīng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)，每塊豬肉的細(xì)菌總數(shù)均小于102CFU/g，證明滅菌效果良好[18].滅菌后的360塊豬肉，分為3組，每組120塊，并將3組樣品分別放置在3種菌液中浸泡15 s后瀝干.

1.3 致腐菌計(jì)數(shù)

對(duì)本實(shí)驗(yàn)不同溫度下貯藏不同時(shí)間、染有不同菌種的豬肉樣本采用相同的致腐菌計(jì)數(shù)方法:在超凈臺(tái)中將豬肉樣本剪碎放入含有10 mL滅菌生理鹽水的滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分研磨制成均勻稀釋液.用無(wú)菌微量移液器吸取0.10 mL樣品勻液，沿管壁緩慢注入盛有10 mL稀釋液的無(wú)菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面)，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液.根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù).

1.4 嗅覺(jué)可視化技術(shù)

1.4.1 氣敏傳感器陣列的制作

為了減少環(huán)境濕度對(duì)傳感器精度的影響，因此選擇具有良好疏水性的C2反相硅膠板作為傳感器載體，其微小的孔徑可以幫助吸附氣體分子加快檢測(cè)速度.利用毛細(xì)管點(diǎn)樣法將4種卟啉氣敏材料和9種pH指示劑氣敏材料固定在傳感器載體上，制成由13個(gè)顏色反應(yīng)點(diǎn)組成的可視化傳感器陣列，如圖1[19].

1.4.2 嗅覺(jué)可視化技術(shù)檢測(cè)

圖1 可視化傳感器陣列Fig.1 Visualization sensor array

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)貯藏溫度:-16，4，20℃，檢測(cè)豬肉在這3種貯藏條件下的變質(zhì)情況.貯藏在-16℃條件下的樣本，每72 h檢測(cè)一次，跟蹤檢測(cè)216 h;貯藏在4℃條件下的樣本，每48 h檢測(cè)一次，跟蹤檢測(cè)144 h;貯藏在20℃條件下的樣本，每8 h檢測(cè)一次，跟蹤檢測(cè)24 h，所有試驗(yàn)每次都進(jìn)行5個(gè)平行實(shí)驗(yàn).

檢測(cè)過(guò)程如下，首先用氮?dú)夥謩e清洗樣品室和氣體反應(yīng)室，用掃描儀獲取傳感器陣列反應(yīng)前的圖像;將檢測(cè)對(duì)象(豬肉樣本)擱置在樣品室中密封集氣;豬肉的揮發(fā)氣體以惰性氣體(氮?dú)?為載氣進(jìn)入反應(yīng)室，與傳感器上顯色材料結(jié)合后發(fā)生顏色變化;對(duì)不同的豬肉樣本經(jīng)不同貯藏時(shí)間后產(chǎn)生的揮發(fā)性氣味，可視化傳感器陣列顯示特定的顏色圖像與其對(duì)應(yīng)，該圖像可通過(guò)掃描儀掃描獲得;測(cè)試一次更換一個(gè)傳感器陣列.

1.4.3 傳感器陣列的特征提取

傳感器陣列中每個(gè)顏色反應(yīng)點(diǎn)圖像用R，G，B3個(gè)顏色分量表達(dá)，可采用計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)來(lái)量化、識(shí)別這種變化.由掃描儀獲得的圖像首先采用中值濾波濾去噪聲，用閾值分割法將顏色反應(yīng)點(diǎn)的圖像從背景中分割出來(lái)，查找傳感器陣列中每個(gè)顏色反應(yīng)點(diǎn)的中心，取每個(gè)顏色反應(yīng)點(diǎn)中心周圍約100個(gè)像素的R，G，B均值作為傳感器的表征值，這樣可有效去除邊緣效應(yīng)的不利影響.將顏色反應(yīng)點(diǎn)反應(yīng)前后R，G，B值差的絕對(duì)值(ΔR=|Ra-Rb|，ΔG=|Ga-Gb|，ΔB=|Ba-Bb|，下標(biāo)a表示反應(yīng)后，下標(biāo)b表示反應(yīng)前)作為顏色反應(yīng)點(diǎn)的響應(yīng)信號(hào).

2 結(jié)果與討論

2.1 致腐菌的生長(zhǎng)情況

當(dāng)寄附于豬肉上的菌落總數(shù)超過(guò)107CFU/g就認(rèn)為肉開(kāi)始變質(zhì)[20].在-16℃的情況下微生物生長(zhǎng)緩慢，各種菌的數(shù)量均比較低，細(xì)菌總數(shù)在第216 h時(shí)達(dá)到107CFU/g，如圖2，3種菌的生長(zhǎng)速率在0.700～0.820左右，其中假單胞菌生長(zhǎng)速率最高;在4℃的情況下，細(xì)菌總數(shù)在第144 h時(shí)達(dá)到107CFU/g，三種菌的生長(zhǎng)速率差距不大，在1.071～1.101左右，其中假單胞菌和熱死環(huán)絲菌生長(zhǎng)速率均較高;在20℃的情況下細(xì)菌的生長(zhǎng)速率明顯加快，細(xì)菌總數(shù)在第16 h時(shí)即達(dá)到107CFU/g，三種菌的生長(zhǎng)速率差距也較大，在1.415～1.661左右，其中假單胞菌生長(zhǎng)速率最高.圖2(a)、(b)、(c)分別為貯藏在 -16，4，20℃條件下各染菌組菌數(shù)的變化.

圖2 豬肉中3種致腐菌菌數(shù)變化情況Fig.2 Bacteria count changes of three spoilage bacterias

如果把寄附于豬肉中的菌落數(shù)1×107CFU/g作為評(píng)判豬肉開(kāi)始變質(zhì)的臨界值，可以認(rèn)為豬肉在-16℃，4℃和20℃條件下分別貯藏216 h，144 h和16 h后已經(jīng)開(kāi)始變質(zhì)，此時(shí)人工嗅覺(jué)尚不能覺(jué)察出變化，用嗅覺(jué)可視化技術(shù)卻可將這種變化情況直觀地表示出來(lái).同時(shí)可以看出在3種貯藏溫度下，假單胞菌的致腐能力最強(qiáng).

2.2 嗅覺(jué)可視化檢測(cè)結(jié)果

由于論文篇幅限制，以下重點(diǎn)分析20℃條件下的嗅覺(jué)可視化技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果.

圖3、圖4、圖5是嗅覺(jué)可視化傳感器檢測(cè)豬肉20℃貯藏條件下產(chǎn)生的揮發(fā)氣味在0～24 h時(shí)間段中的幾幅特征圖像，每幅圖的反應(yīng)變化都有所不同.這是由于不同的菌產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體的百分含量有一定的差異，并且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，豬肉頂空揮發(fā)性氣體成分的種類和濃度不斷變化引起的.

對(duì)于不同組的樣本而言，氣敏傳感器陣列的特征響應(yīng)值是不同的，同一組樣本，在不同的貯藏階段氣敏傳感器陣列的特征響應(yīng)值也是不同的，并且隨著時(shí)間的推移，豬肉變質(zhì)程度的加深，特征點(diǎn)的亮度不斷加深，即傳感器陣列上特征點(diǎn)顏色變化程度不斷加深.

通過(guò)圖3至圖5，可以看出傳感器陣列上13個(gè)顏色反應(yīng)點(diǎn)的顏色變化較為直觀地反映了豬肉的新鮮度變化，但尚缺少具體的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn).

圖3 20℃染有梭狀芽孢桿菌豬肉樣本0～24 h特征圖像Fig.3 Feature images of Clostridium group sample under 20℃during 8～24 h

圖4 20℃染有熱死環(huán)絲菌豬肉樣本8～24 h特征圖像Fig.4 Feature images of Brochothix thermosphacta group sample under 20℃during 8～24 h

圖5 20℃染有假單胞菌豬肉樣本8～24 h特征圖像Fig.5 Feature images of Pseudomonas group sample under 20℃during 8～24 h

隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)、豬肉腐敗程度加深，每一個(gè)顏色反應(yīng)點(diǎn)的亮度也在增強(qiáng)，也就是說(shuō)豬肉新鮮度越低ΔR，ΔG，ΔB響應(yīng)值越高，因此可以通過(guò)傳感器陣列上13個(gè)顏色反應(yīng)點(diǎn)的ΔR，ΔG，ΔB響應(yīng)值的總和來(lái)判斷豬肉的新鮮度.表1和表2分別為20℃條件下貯藏16 h和24 h后各組豬肉樣本的菌落數(shù)和顏色反應(yīng)點(diǎn)的ΔR，ΔG，ΔB的總和.對(duì)于同一組樣本，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，ΔR，ΔG，ΔB的總和也在增加.對(duì)照2.1致腐菌生長(zhǎng)情況，20℃條件下貯藏16 h時(shí)所有豬肉樣本的菌落數(shù)達(dá)到107CFU/g以上，可以把該條件下傳感器陣列上13個(gè)顏色反應(yīng)點(diǎn)的ΔR，ΔG，ΔB之和的最小值532(表1)定為豬肉開(kāi)始變質(zhì)的臨界點(diǎn).同樣可以得出，貯藏在-16℃條件下豬肉開(kāi)始變質(zhì)的臨界點(diǎn)為543;貯藏在4℃條件下豬肉開(kāi)始變質(zhì)的臨界點(diǎn)為772，受篇幅所限不再展開(kāi)來(lái)介紹.

表1 20℃ 16 h時(shí)13個(gè)顏色反應(yīng)點(diǎn)的 ΔR，ΔG，ΔB 之和Tab.1 Change of RGB of pH indicator during 16 h under 20℃

表2 20℃ 24 h時(shí)13個(gè)顏色反應(yīng)點(diǎn)的 ΔR，ΔG，ΔB 之和Tab.2 Change of RGB of pH indicator during 24 h under 20℃

3 結(jié) 論

本文根據(jù)微生物計(jì)數(shù)法分析寄附于豬肉上的微生物菌數(shù)及豬肉的變質(zhì)情況作為背景知識(shí)，將4種卟啉類化合物以及9種pH指示劑制成可視化傳感器陣列，與-16℃，4℃和20℃三種不同貯藏溫度下，染有三種優(yōu)勢(shì)致腐菌的豬肉所產(chǎn)生揮發(fā)氣體發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)寄附于豬肉上的菌落總數(shù)達(dá)到臨界值，豬肉開(kāi)始變質(zhì)時(shí)，與其對(duì)應(yīng)的特定顏色圖像(由13個(gè)顏色反應(yīng)點(diǎn)組成)的ΔR+ΔG+ΔB值可作為豬肉開(kāi)始變質(zhì)的臨界判斷值，ΔR+ΔG+ΔB值越大，豬肉新鮮度越低.研究結(jié)果表明，嗅覺(jué)可視化技術(shù)可直接跟蹤豬肉變質(zhì)過(guò)程中揮發(fā)性氣味的變化，并可實(shí)現(xiàn)數(shù)字表達(dá)，與常用的檢測(cè)豬肉新鮮度的方法相比，更直觀、簡(jiǎn)便、快速，是一種具有較高應(yīng)用前景的食品安全檢測(cè)技術(shù).

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