孫敘敏 陳信義

(1 煤炭總醫(yī)院中醫(yī)科，北京，100028;2 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院腫瘤血液科，北京，100700)

研究發(fā)現(xiàn)，周期素D1(Cyclin D1)的過度表達在許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用［1－5］，下調(diào)Cyclin D1的表達進而影響腫瘤細胞G1/S的過渡在一定程度上可以抑制增殖，延緩進展［6－7］，并增強腫瘤細胞對藥物的敏感性［8］。CD44 屬于黏附分子家族成員之一，目前研究主要致力于CD44 與惡性腫瘤臨床病理特點的關系上，研究結果尚不統(tǒng)一［9］，多數(shù)研究認為CD44的過度表達參與了惡性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移，推測其可能成為惡性腫瘤的不良預后因子。本研究采用免疫組化技術，集中觀察經(jīng)典古方宋“兩儀膏”改制成的復方制劑復方阿膠漿對Cyclin D1、CD44 表達的影響，古方新用，從抗腫瘤機制方面探索復方阿膠漿的臨床應用。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性C57BL/6 小鼠108只，清潔級，體重15～18 g，購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心［許可證號:SCXK(軍)2007－004］，于中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所SPF 級動物室飼養(yǎng)。Lewis 肺癌(Lewis Lung carcinoma LLC)瘤源由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所提供。復方阿膠漿(阿膠、黨參、人參、熟地黃、山楂)，20 mL/支，山東東阿阿膠股份有限公司制備并提供(批號:091146);注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，200 mg/支，山西普德藥業(yè)有限公司，國藥準字H14023686。兔抗CD44(批號:BA0321)一抗、兔鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶(SP)試劑盒SP900l、DAB 顯色劑(批號:AR1022)均購自武漢博士德公司、兔抗CyclinD1(批號:bs－0623R)一抗購自北京博奧森生物技術有限公司。Olympus 公司IMT－2 倒置顯微鏡;美國Diagnostic Instrument Inc Spot－II 數(shù)碼成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 荷lewis 肺癌的C57BL/6 小鼠脫頸處死，完整剝離瘤塊，以生理鹽水研磨，調(diào)細胞密度約2×107/mL(臺盼藍計數(shù)活細胞＞90%)，每只小鼠右腋皮下接種0.2 mL。接種后第3日，按體重隨機分為6組，分別為模型對照組、CTX組、復方阿膠漿組(中劑量)、復方阿膠漿(大、中、小劑量)聯(lián)合CTX組，每組10只，稱體重并編號［10］。

1.2.2 給藥方法 模型對照組予生理鹽水0.4 mL，連續(xù)灌胃12 d;CTX組，隔日腹腔注射0.2 mL，共給藥6 d(CTX 給藥劑量為35 mg/kg);復方阿膠漿組(即中劑量組)，予復方阿膠漿原液0.2 mL +生理鹽水0.2 mL 灌胃12 d;復方阿膠漿大、中、小劑量聯(lián)合CTX組分別予復方阿膠漿原液0.4 mL、復方阿膠漿原液0.2 mL+生理鹽水0.2 mL、復方阿膠漿0.1 mL +生理鹽水0.3 mL 灌胃12 d(復方阿膠漿臨床常規(guī)用量為60 mL/d，即每20 mL 該液體中含阿膠3 g)，其中CTX 給藥方式及劑量同CTX組。以上給藥劑量均按照人鼠體表面積折算，復方阿膠漿中劑量為成人劑量的9 倍。

1.2.3 觀察指標 1)移植瘤CyclinD1、CD44 免疫組化檢測:末次給藥24 h 后處死小鼠，取各組腫瘤組織標本，用10 %甲醛在4℃下固定48 h，經(jīng)脫水、透明、浸蠟及包埋制成蠟塊。每組選8個蠟塊，按5μm 厚度連續(xù)切片，固定于防脫玻片。染色步驟參照SP 法試劑盒，CyclinD1的稀釋濃度為1∶20;CD44的稀釋濃度為1∶25。以PBS 代替一抗作為陰性對照，以已知的陽性切片為陽性對照。在光鏡下觀察陽性反應呈團塊狀或灶狀的棕黃色或褐色。封片后以美國Diagnostic Instrument Inc Spot－Ⅱ數(shù)碼成相系統(tǒng)拍照，觀察蛋白表達。以Universal Imaging Corporation Meta Morph分析系統(tǒng)對結果進行半定量分析，每張片子取5個視野，在400(40×10)倍顯微鏡下，設置統(tǒng)一閾值分析陽性信號的平均光密度(AOD)，以5個視野的平均值作為該片的數(shù)據(jù)。2)觀察生存期:同期飼養(yǎng)48只C57BL/6 荷lewis 肺癌小鼠，每組8只，觀察2個月，造模、分組及給藥方法同上。以此來大體判斷給藥各組的預后情況。

2 結果

2.1 對瘤組織Cyclin D1、CD44 表達的影響及兩指標之間相關性

2.1.1 各組對瘤組織Cyclin D1 表達的影響 復方阿膠漿組、復方阿膠漿大劑量聯(lián)合CTX組能明顯下調(diào)CyclinD1的表達水平，AOD值分別為(0.213 3±0.020 4)、(0.223 0±0.020 1)，與模型組比較(0.260 9±0.027 2)，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);聯(lián)合用藥各組與單用CTX組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1，各組CyclinD1 染色情況見圖1A－F。

圖1 實驗各組瘤組織CyclinD1 表達情況(SP×400)

表1 復方阿膠漿對LLC組織CyclinD1、CD44 表達的影響(，n=8)

表1 復方阿膠漿對LLC組織CyclinD1、CD44 表達的影響(，n=8)

注:與模型對照組相比，* P＜0.05。

2.1.2 各組對瘤組織CD44 表達的影響 復方阿膠漿組、CTX組、復方阿膠漿大、中劑量聯(lián)合CTX組能下調(diào)CD44的表達，AOD值分別為(0.195 9±0.014 0、0.191 9±0.022 5、0.191 1±0.022 4、0.184 3±0.024 8)，與模型組比較(0.225 0±0.027 4)有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);聯(lián)合用藥各組與單用CTX組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1，各組CD44 染色情況見圖2A－F。

2.1.3 瘤組織CyclinD1 與CD44 線性相關性 經(jīng)直線相關性檢驗，CyclinD1 與CD44 二者相關系數(shù)為r=0.232 21(P＞0.05)，表示二者之間無明顯線性相關關系，見表2。

表2 六組LLC組織的CyclinD1 與CD44的相關性()

表2 六組LLC組織的CyclinD1 與CD44的相關性()

圖2 實驗各組CD44 表達情況(SP×400)

2.2 復方阿膠漿對各組小鼠生存期的影響 實驗證明，復方阿膠漿組的生存時間最長，約(27.3±6.9)d;模型對照組的生存時間最短，約(17.6±4.3)d，二者經(jīng)t 檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。經(jīng)Kaplan－Meier 法生存分析，各組間均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表3。

表3 復方阿膠漿對荷lewis 肺癌鼠生存期的影響(，n=8)

表3 復方阿膠漿對荷lewis 肺癌鼠生存期的影響(，n=8)

注:與模型組比，＊＊P＜0.01。

3 討論

3.1 Cyclin D1的表達與肺癌的關系 Cyclin D1 是G1/S 期過渡的重要調(diào)控因子，可刺激周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)介導Rb 基因蛋白產(chǎn)物的磷酸化，使Rb基因?qū)毎L的抑制效應失活，從而使細胞周期進入DNA 合成期，病理狀態(tài)下即可使細胞轉(zhuǎn)化成腫瘤細胞。大多數(shù)學者認為Cyclin D1 單獨或與另外的癌基因編碼產(chǎn)物共同參與肺癌的發(fā)生。如賀駿等人對包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，正常組織中不表達或者低表達Cyclin D1，而在肺癌組織中表達率高達56.8%，明顯高于正常組織，即提示了Cyclin D1 在肺癌形成中可能起了至關重要的作用［11］。劉潔等人對女性肺腺癌患者研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1 表達高者，腫塊形成大，亦提示了肺腺癌的形成與Cyclin D1的高表達有關［12］。進一步多個小樣本研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1 蛋白的表達與肺癌患者吸煙與否、腫瘤大小、疾病分期相關，與分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移情況關系不確切，吸煙、腫塊大、分期晚者，Cyclin D1 表達陽性率高，并可能是Ⅰ期非小細胞肺癌患者極有意義的預后因子［13－16］。Cyclin D1 蛋白表達對肺癌患者的危險分層、病情評估、預后有一定的臨床應用價值。

近年來在干預Cyclin D1 表達進而防治肺癌的研究中我們發(fā)現(xiàn)中藥制劑越來越多，如消積飲可能通過降低小鼠lewis 肺癌細胞Cyclin D1的表達從而抑制lewis 肺癌生長［17］;肺抑瘤合劑配合化療能有效抑制腫瘤細胞Cyclin D1、p53的表達，進而發(fā)揮其抗腫瘤作用［6］。有一項研究初步顯示了中藥在干預CyclinD1中不同于西藥的優(yōu)勢所在，雙黃升白顆粒對骨髓抑制Lewis 肺癌荷瘤小鼠的細胞周期具有雙重調(diào)控作用，能夠上調(diào)骨髓CDK4、CDK6、CyclinD1 表達、下調(diào)腫瘤組織CDK4、CDK6、CyclinD1 表達［18］，從而在發(fā)揮抗腫瘤效應的同時，又能促進骨髓造血功能，即有減毒性。

3.2 CD44的表達與肺癌的關系 CD44 是黏附分子家族的一員，有多種亞型，介導黏附，參與淋巴細胞的歸巢和活化，參與信號轉(zhuǎn)導、參與造血等，發(fā)揮著廣泛的生物學效應，近年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起到了重要的作用，尤其是對腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移與預后。既往研究對CD44 基因在肺癌中的表達情況報道結果不一，甚至相反。近兩年國內(nèi)研究普遍認為，CD44 與肺癌的組織學類型、分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移及生存時間相關，而與年齡、腫瘤大小、性別、TNM分期無關［19－22］，用到的實驗方法多數(shù)為免疫組化，少數(shù)用到RT－PCR。目前有關拮抗CD44、下調(diào)其表達水平的試驗藥品比較鮮見，如有學者研究益肺清化膏的抗癌機制時發(fā)現(xiàn)其可下調(diào)CD44、CD44v6的表達水平，推測該藥可能通過減弱腫瘤細胞與血管內(nèi)皮ECM 間的異質(zhì)黏附，降低腫瘤向基質(zhì)的侵襲，而達成抗腫瘤的目標［23］。張培彤等人采用流式細胞計數(shù)法研究了蘇木及聯(lián)合化療的抗腫瘤機制，與模型組比較，可在不同時期明顯下調(diào)CD44的表達水平［24］。

本實驗基于前期復方阿膠漿對lewis 肺癌抑瘤率、外周血象及其他因子的表達的影響研究基礎上發(fā)現(xiàn)，復方阿膠漿組、復方阿膠漿大劑量聯(lián)合CTX組能明顯下調(diào)cyclinD1的表達水平(P＜0.05);復方阿膠漿組、CTX組、復方阿膠漿大、中劑量聯(lián)合CTX組能下調(diào)CD44的表達，與模型組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。推測復方阿膠漿的抗腫瘤效應可能與干預CyclinD1/CDK4 激活的信號通路、下調(diào)CD44的表達從而影響腫瘤細胞的活動能力相關。本研究未發(fā)現(xiàn)CyclinD1 與CD44的表達有明顯的統(tǒng)計學相關性，可能二者的作用途徑不存在交叉性。在觀察生存期的實驗中發(fā)現(xiàn)復方阿膠漿組的生存時間最長，與模型對照組有明顯的差異。雖然經(jīng)Kaplan－Meier 法生存分析，未發(fā)現(xiàn)在統(tǒng)計學上的差異性，但復方阿膠漿在抗腫瘤、下調(diào)上述指標表達的同時，仍有延長生存期的趨勢，今后有待聯(lián)合多個指標進一步的研究。

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