朱蓮英，吳鳳芝，趙志祥，王會芳，陳綿才*海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與植物保護研究所，海南省植物病蟲害防控重點實驗室，海南?？?700;海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院，海南?？?708

植物寄生線蟲是一類重要的病原物，分布廣，種類多，全世界已報道的植物寄生線蟲有200多個屬5000余種，給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害(馮志新，2001)?，F(xiàn)階段植物寄生線蟲病的防治多采用化學(xué)藥劑、輪作和抗病品種，對于香蕉這種多代生長的植物來說，輪作可行性較小。目前使用的化學(xué)殺線劑一般屬高毒、高殘留農(nóng)藥，不但給微生物、植物、水源和大氣層帶來嚴(yán)重污染和破壞，而且會直接對人體造成危害。近年來，隨著國家大力倡導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，線蟲生物防治越來越受到重視，特別是利用細(xì)菌、真菌的代謝產(chǎn)物控制線蟲病害已取得顯著成果(劉丹丹，2007;牛秋紅等，2010)。由于根際細(xì)菌是從植物根際分離所得，具有與根親和力強、拮抗性強、易于培養(yǎng)應(yīng)用等特點，利用根際細(xì)菌防治寄生線蟲已成為國內(nèi)外研究熱點之一(郭榮君等，1996)。目前，已有堅強芽孢桿菌Bacillus firmus、巨大芽孢桿菌B.megaterium、短小桿菌Curtobacterium luteum、熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens和惡臭假單胞菌P.putida對相似穿孔線蟲Radopholus similis(Cobb)Thorne具有拮抗活性的報道(Aaltenet al.，1998;Aravindet al.，2010;Mendozaet al.，2008)。筆者運用等比稀釋涂布平板法試圖從染病香蕉植株根際土壤分離菌株，通過室內(nèi)生物測定和盆栽試驗，篩選獲得對相似穿孔線蟲具有毒殺活性的菌株，以期為相似穿孔線蟲病的生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

土樣采集:采用十點取樣法從5～15 cm土層采集感染相似穿孔線蟲的香蕉根際土壤，共采集39份土樣。土樣自然風(fēng)干后過200目篩，封裝于密封袋中并編號，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

供試線蟲:相似穿孔線蟲由海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與植物保護研究所植物病理實驗室保存于胡蘿卜愈傷組織上。

供試植物:香蕉Musa paradisiacaL.。

1.2 拮抗菌株的分離和保存

采用等比稀釋分離法分離拮抗菌株。每個土樣稱取5 g粉末置于無菌三角瓶中，加入100 mL無菌水，于160 r·min－1振蕩 30 min，按 10 倍稀釋法依次稀釋至 10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。各吸取 200 μL稀釋液涂布于KB培養(yǎng)基平板上，用封口膜封好，培養(yǎng)皿放于28℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。每個土樣和稀釋梯度均重復(fù)3次。

挑取單菌落于裝有1 mL液體培養(yǎng)基的2 mL無菌離心管中，在160 r·min－1、28 ℃下?lián)u床振蕩12 h。然后用無菌移液槍吸取200 μL菌液與60 μL 50%甘油混合于96孔板中，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 相似穿孔線蟲的培養(yǎng)

將分離獲得的相似穿孔線蟲進(jìn)行純化培養(yǎng)。從中挑選活力較強的相似穿孔線蟲25條置于盛有1 mL無菌水的2 mL無菌試管中，加入0.5 mL 0.5%硫酸鏈霉素，3～6 h后，用無菌移液槍吸去上層液，加入1 mL無菌水，輕輕震蕩。然后以4℃、3500 r·min－1離心 3 min，棄上清液，再加無菌水，離心，重復(fù)2～3次。超凈工作臺上用滅菌移液槍將無菌線蟲懸浮液吸到胡蘿卜愈傷組織上，置于25℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)40～60 d，獲大量純化的相似穿孔線蟲備用(陳淳等，2006)。

1.4 分離菌株的培養(yǎng)與上清液的制備

采用搖瓶發(fā)酵法，從－20℃冰箱中取出96孔板，分別吸1 μL菌液于裝有20 mL NA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于28℃下160 r·min－1搖床振蕩培養(yǎng)72 h。分離菌株的培養(yǎng)物于 4℃、6000 r·min－1離心2 min，取上清液備用。

1.5 相似穿孔線蟲拮抗菌株的篩選

分離的細(xì)菌菌株對相似穿孔線蟲的活性測定在24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行。每孔加入1 mL分離菌株的上清液和相似穿孔線蟲約300條·孔－1，以無菌水處理為對照，每個處理重復(fù)3次。處理4、8、12、24和48 h后分別觀察和計數(shù)。基于供試線蟲的假死現(xiàn)象，在體視顯微鏡下用自制毛筆刺激線蟲，僵直不動視為死亡，呈彎曲蠕蟲狀為活蟲。

生測結(jié)果計算參照陳立杰等(2008)的方法:線蟲死亡率(%)=死亡線蟲數(shù)/供試線蟲數(shù)×100。

數(shù)據(jù)處理采用EXCEL 2003軟件，統(tǒng)計分析采用DPS v7.05軟件，用Duncan's新復(fù)極差法在5%顯著水平上進(jìn)行多重比較。

1.6 盆栽試驗

采用發(fā)酵液浸根和灌根法測定拮抗菌株發(fā)酵液對相似穿孔線蟲的活性。將獲得的拮抗菌株菌劑濃度調(diào)至 109cfu·mL－1，以 1.8%阿維菌素乳油1500倍液作陽性對照，以無菌水作陰性對照。用供試菌株的培養(yǎng)液浸泡香蕉根部10 min，移栽入塑料缽中，每缽1株香蕉苗，重復(fù)3次;再用相應(yīng)生防菌劑灌根處理，每株3 mL。48 h后接相似穿孔線蟲，每盆接種線蟲1500條，7 d后用相應(yīng)菌劑灌根處理，每株3 mL。接種42和70 d后，將植株整盆倒出，測量香蕉株高、根質(zhì)量和莖圍，計數(shù)根部相似穿孔線蟲數(shù)量，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，方法同1.5。

生防效果測定參照Chaveset al.(2009)的方法:BC(%)=100×［1－(NT/NC)］。

式中:NT指拮抗菌處理存活的線蟲數(shù)量，NC指空白對照存活的線蟲數(shù)量。

1.7 拮抗菌株的分子鑒定

1.7.1 細(xì)菌菌液的制備 從劃線培養(yǎng)的平板上挑取單菌落接種到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r·min－1振蕩培養(yǎng)12 h，活化菌株備用。

1.7.2 16S rDNA的PCR擴增和序列分析 細(xì)菌基因組的提取及16S rDNA的擴增參照牛秋紅等(2005)的方法，采用細(xì)菌通用引物 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492 R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')進(jìn)行擴增(趙志祥等，2010)。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并按照百泰克膠回收試劑盒的說明，回收約1.5 kb的DNA片段。

1.7.3 測序及序列分析 將上述回收的DNA片段連接到克隆載體pMD18T(TaKaRa)上，篩選陽性克隆載體并送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將拼接好的序列在Blast軟件的Genbank數(shù)據(jù)庫中搜索相似性，選取同源性最高的典型菌株進(jìn)行序列比對分析及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從而對菌株進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株上清液對相似穿孔線蟲幼蟲的活性

對分離到的789株細(xì)菌菌株進(jìn)行殺線蟲活性初步篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，96株供試菌株的發(fā)酵上清液對相似穿孔線蟲幼蟲的致死率均達(dá)到80%以上。其中，5 株細(xì)菌(編號 HD-34、HD-46、HD-54、HD-86、HD-93)菌株發(fā)酵上清液在24 h內(nèi)對相似穿孔線蟲幼蟲的致死率達(dá)90%以上，在48 h內(nèi)致死率達(dá)100%(表 1、圖1)。

表1 拮抗菌株上清液對相似穿孔線蟲的活性Table 1 Activity of antagonistic strains supernatants on R.similis

圖1 5個菌株發(fā)酵上清液24 h對相似穿孔線蟲的拮抗作用Fig.1 Effect of five antagonistic bacterial supernatant on R.similis，24 hours after inoculation

2.2 拮抗菌株發(fā)酵液對香蕉相似穿孔線蟲的防控效果

結(jié)果表明，接種5株拮抗細(xì)菌42 d后，各處理的香蕉根部存活線蟲數(shù)量均大幅度減少，其中以HD-86表現(xiàn)最好，相對防治效果達(dá)77.34%，與阿維菌素的防效相當(dāng)(表2)。接種70 d后，HD-86和HD-54處理的香蕉根部存活的線蟲數(shù)量持續(xù)下降，相對防效分別達(dá)90.51%和90.18%，而阿維菌素的防效僅為63.97%;此時，與空白對照相比，5株拮抗細(xì)菌處理的香蕉植株株高、莖直徑和根質(zhì)量均明顯增大，差異均達(dá)顯著水平(表3)。從結(jié)果還可以看出，5個拮抗細(xì)菌菌株在接種后42～70 d對相似穿孔線蟲的防治效果均呈上升態(tài)勢，而阿維菌素的防治效果卻明顯下降，表明這些拮抗菌株對相似穿孔線蟲的防控具有較長的持效期。

2.3 拮抗菌株16S rDNA的PCR擴增和序列分析

2.3.1 PCR產(chǎn)物電泳及回收轉(zhuǎn)化 以提取和純化的拮抗細(xì)菌基因組 DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收，獲得約1500 bp的DNA片段(圖2)。

2.3.2 序列分析 經(jīng)上海生工生物技術(shù)有限公司測序，從菌株 HD-34、HD-46、HD-54、HD-86 和 HD-93中擴增所獲得的基因片段分別為1665、1516、1509、1509和1516 bp，其與Genbank數(shù)據(jù)庫中屬的相似性見表4。

表2 室內(nèi)盆栽香蕉接種拮抗細(xì)菌42 d后對相似穿孔線蟲的作用效果Table 2 Control effect of five antagonistic bacteria on R.similis in potting banana trial in greenhouse，42 days after inoculation

表3 室內(nèi)盆栽香蕉接種拮抗細(xì)菌70 d后對相似穿孔線蟲的作用效果Table 3 Control effect of five antagonistic bacteria on R.similis in potting banana trial in greenhouse，70 days after inoculation

圖2 拮抗菌株16S rDNA基因擴增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification of antagonistic bacteria 16S rDNA gene by bacterial universal primers

表4 5株拮抗細(xì)菌菌株與屬的相似性Table 4 The similis of five antagonistic bacteria with genus

將測定的拮抗菌株HD-86的基因序列結(jié)果登錄Genbank進(jìn)行Blast檢索，并與已報道的16S rDNA序列進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，發(fā)現(xiàn)該菌株的序列與Burkholderia cepaciaisolate MSMB10單獨構(gòu)成一個分支，由此將其鑒定為洋蔥伯克氏菌Burkholderia cepacia。

圖3 菌株HD-86的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain HD-86

3 討論

細(xì)菌的繁殖速度快，易于培養(yǎng)，所需要的養(yǎng)分簡單，成本低，因而利用細(xì)菌開發(fā)環(huán)保生物農(nóng)藥防治植物線蟲病害，越來越具有研究和應(yīng)用價值。然而，目前我國對細(xì)菌的殺線蟲活性機理方面的研究起步較晚，需要篩選出大量的具有殺線蟲活性的細(xì)菌資源為其提供研究基礎(chǔ)(牛秋紅等，2005)。本研究從香蕉根際土壤獲得了5株對相似穿孔線蟲具有拮抗活性的細(xì)菌菌株，一定程度上豐富了殺線蟲微生物的利用資源。

前人研究證實，植物線蟲拮抗細(xì)菌有芽孢桿菌和熒光假單胞桿菌等(Aaltenet al.，1998;Aravindet al.，2010)。本文從染病香蕉植株根際土壤分離物中篩選到1株編號為HD-86的對相似穿孔線蟲具有極高拮抗活性的細(xì)菌菌株，并將其鑒定為伯克霍爾德菌屬下的洋蔥伯克氏菌。據(jù)報道，伯克霍爾德菌屬細(xì)菌能抑制植物病原真菌，具有生物防治和促進(jìn)植物生長的功能(陳京元等，2011;權(quán)春善等，2005)。本研究的生物測定和盆栽試驗結(jié)果表明，菌株HD-86不僅能有效地控制相似穿孔線蟲的種群數(shù)量，而且持效期長，同時明顯促進(jìn)香蕉植株生長。這可能與香蕉根部接種HD-86后，細(xì)菌在植株根部區(qū)域大量增殖，或者產(chǎn)生某些混合物質(zhì)共同抑制相似穿孔線蟲的生長與繁殖有關(guān)，也可能是其誘導(dǎo)植物抗性，從而減輕了線蟲對香蕉植株的侵染(Perry＆Moens，2012)。盡管如此，洋蔥伯克氏菌對相似穿孔線蟲的作用方式和作用機理，以及其能否開發(fā)成菌劑進(jìn)行商品化生產(chǎn)，均有待進(jìn)一步探索和研究。

陳淳，謝輝，蔚應(yīng)俊，韓玉春，秦丹，黃春曉，唐炯.2006.香蕉相似穿孔線蟲培養(yǎng)技術(shù)及其種群繁殖力研究.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，27(1):61－64.

陳京元，蔡三山，林親雄.2011.洋蔥伯克霍爾德菌C23抗真菌活性多肽的分離純化.林業(yè)科技開發(fā)，25(4):22－24.

陳立杰，劉彬，段玉璽，張國棟.2008.白僵菌發(fā)酵液對不同種類線蟲生物活性的影響.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，39(3):305－308.

馮志新.2001.植物線蟲學(xué).北京:中國農(nóng)業(yè)出版社.

郭榮君，劉杏忠，楊懷文.1996.應(yīng)用根際細(xì)菌防治植物寄生線蟲的研究.中國生物防治，12(3):134－137.

劉丹丹.2007.球孢白僵菌殺線活性物質(zhì)分離純化研究.沈陽:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，

牛秋紅，董冰雪，黃思良，惠豐立，柯濤，張林.2010.松材線蟲生防細(xì)菌的篩選、鑒定及其毒性因子的初步研究.中國生物工程雜志，30(8):76－81.

權(quán)春善，鄭維，曹治明，王軍華，范圣第.2005.洋蔥伯克霍爾德菌CF66抗菌物質(zhì)的分離純化及性質(zhì)的研究.微生物學(xué)報，45(5):707－710.

趙志祥，蘆小飛，陳國華，楊宇紅，茆振川，劉二明，謝丙炎.2010.溫室黃瓜根結(jié)線蟲發(fā)生地土壤微生物宏基因組文庫的構(gòu)建及其一個殺線蟲蛋白酶基因的篩選.微生物學(xué)報，50(8):1072－1079.

Aalten P M，Vitour D，Blanvillain D，Gowen S R and Sutra L.1998.Effect of rhizosphere fluorescentPseudomonasstrains on plant-parasitic nematodesRadopholus similisandMeloidogynespp..Letters in Applied Microbiology，27:357 －361.

Aravind R，Eapen S J，Kumar A，Dinu A and Ramana K V.2010.Screening of endophytic bacteria and evaluation of selected isolates forsuppression ofburrowing nematode(Radopholus similisThorne)using three varieties of black pepper(Piper nigrumL.).Crop Protection，29:318 －324.

Chaves N P，Pocasangre L E，Elango F，Rosales F E and Sikora R.2009.Combining endophytic fungi and bacteria for the biocontrol ofRadopholus similis(Cobb)Thorne and for effects on plant growth.Scientia Horticulturae，122:472－478.

Mendoza A R，Kiewnick S and Sikora R A.2008.In vitro activity ofBacillus firmusagainst the burrowing nematodeRadopholus similis，the root-knot nematodeMeloidogyne incognitaand the stem nematodeDitylenchus dipsaci.Biocontrol Science and Technology，18:377 －379.

Perry R N and Moens M.2012.植物線蟲學(xué).簡恒，譯.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社.