李 琴，楊清松，徐 彬，毛建文

(廣東藥學院，廣州510006)

免疫熒光技術是生命科學和醫(yī)學檢驗中常用的蛋白表達分布的檢測手段，具有特異性強、敏感性高、速度快等優(yōu)點。其基本原理為利用抗體和抗原的特異結合，在抗體上耦聯(lián)熒光物質(zhì)，通過激發(fā)光的激發(fā)，觀測熒光在組織和細胞中的位置及其強度，以推斷目的蛋白的表達位置及表達強度，以此獲知機體可能出現(xiàn)的病理性變化，同時也可用于研究疾病與特定生物大分子之間的關系及其機理［1］。紅細胞是血液中最主要的血細胞，其主要生理功能為運載氧氣，同時也在機體免疫識別和應答中起作用［2］。哺乳動物和人的成熟紅細胞為雙凹圓盤結構，無細胞核，細胞內(nèi)主要為血紅蛋白，細胞骨架系統(tǒng)薄弱，細胞膜脆弱，對環(huán)境刺激敏感，極易發(fā)生細胞破碎、溶血。在紅細胞的免疫熒光檢測技術中，細胞膜完整時抗體難以進入細胞內(nèi)，破膜處理則極易使紅細胞溶血，導致難以在紅細胞進行免疫熒光細胞化學的檢測［3，4］。氯通道蛋白 ClC-3是電壓門控氯通道的ClC家族成員之一。ClC-3蛋白主要表達于細胞質(zhì)內(nèi)的囊泡膜和胞膜［5］。胞膜ClC-3被認為是最可能編碼容積激活性氯通道的基因，通過容積激活性氯電流參與細胞容積的調(diào)節(jié)，從而涉及細胞增殖、分化和遷移的調(diào)控［6］;囊泡膜上的ClC-3則作為氯通道參與了囊泡的酸化過程［7］。2012年3月1日～7月30日，我們通過優(yōu)化固定液、透膜液、封閉液和洗滌液，解決了常規(guī)免疫細胞化學法導致紅細胞易溶血的缺點，建立了一種不溶血的紅細胞免疫熒光細胞化學檢測方法?，F(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1．1 實驗材料與試劑 紅細胞來源于SD大鼠;兔抗人(鼠)ClC-3抗體購自Abcam公司;Alexa Fluor 488標記山羊抗兔購自碧云天;多聚賴氨酸(0．5 mg/mL)處理的載玻片。PBS緩沖液:NaCl 137 mmol/L，KCl 2．7 mmol/L，K2HPO48．1 mmol/L，KH2PO41．5 mmol/L。固定液:0．5%丙烯醛溶于PBS緩沖液。透膜液:含0．1 mol/L甘氨酸和0．1%的Triton X-100的PBS溶液。封閉液:含0．05 mmol/L 甘氨酸、2%BSA、0．05%NaN3的PBS溶液。洗滌液:含0．1 mol/L甘氨酸和5 mmol/L葡萄糖的PBS溶液。

1．2 方法 ①細胞采集:取SD大鼠尾靜脈血5 μL，置1．5 mL的EP管中［預先加入20μL的EDTA(15 g/L)的PBS溶液］，混勻，加入175μL的PBS，混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清再用PBS清洗2次，細胞備用。②細胞涂片:將備用細胞用0．4 mL PBS稀釋，取40μL，用玻片離心機1 000 r/min離心5 min后涂片。③細胞固定:細胞涂片加固定液40 μL，室溫固定5 min。④透膜:輕輕吸去細胞涂片上的固定液，加透膜液(先行最適透膜液濃度梯度實驗，以確定最合適的透膜液濃度)40μL，室溫作用3 min。⑤封閉:細胞涂片用洗滌液洗3次，每次5 min，封閉液30μL作用60 min，吸出封閉液。⑥孵育一抗:將兔抗人(鼠)ClC-3抗體(1∶50稀釋)10 μL加至細胞涂片，4℃孵育過夜，洗滌液洗3次，每次5 min。⑦孵育二抗:Alexa Fluor 488耦聯(lián)的山羊抗兔(1∶100稀釋)15μL加至細胞涂片，室溫避光孵育1 h，洗滌液洗3次，每次5 min。⑧染核:細胞涂片加細胞核染色液(DAPI)10μL，室溫染色5 min，PBS洗3次，每次5 min。⑨封片及觀察:細胞涂片滴加適量的抗熒光淬滅封片液，蓋玻片封片后激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結果

2．1 最適透膜液濃度 紅細胞細胞免疫熒光實驗中除了固定液成分容易導致溶血外，透膜處理是另一極易引起紅細胞膜裂解的環(huán)節(jié)。針對這一問題，對紅細胞對透膜液(Triton X-100)的耐受性進行了檢測，結果顯示，Triton X-100濃度約為0．01%時紅細胞不會出現(xiàn)溶血現(xiàn)象(表1)。

表1 最適透膜液濃度梯度實驗結果

2．2 紅細胞ClC-3蛋白的表達 激光共聚焦顯微鏡下觀察結果見圖1。圖1Aa為大鼠紅細胞經(jīng)過0．5%丙烯醛和0．01%的Triton X-100處理后在顯微鏡下明場觀察的結果，可見紅細胞仍呈典型的雙凹碟盤狀結構，仍然保持細胞結構的完整。圖1Ab、圖1Ac為熒光染色后的紅細胞，其綠色熒光信號主要集中在細胞周緣，提示ClC-3在正常紅細胞主要表達于細胞膜，與血中有核細胞同時表達在胞膜和胞質(zhì)的特點差別明顯(圖1B)。

3 討論

紅細胞的細胞膜比較脆弱，易發(fā)生溶血現(xiàn)象［8，9］。選用合適的固定劑，可有效防止細胞的破碎。常用的紅細胞固定劑有甲醇、甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙烯醛等［10～12］。經(jīng)過試用，我們用 0．5%丙烯醛作固定劑得到了較好的效果。其發(fā)揮作用的原理可能為丙烯醛的醛基與膜蛋白上的氨基交聯(lián)，形成網(wǎng)絡，從而加強了紅細胞膜的機械強度［13，14］。

免疫熒光中使用的抗體所抗區(qū)段為的目蛋白的胞內(nèi)區(qū)段時，必須使用表面活性劑，有效地使細胞膜穿孔，便于抗體進入，以同目的蛋白結合，但同時又不能過量，以保持細胞的穩(wěn)定性。常用的表面活性劑有 Triton X-100［15］、Tween-20 等。對于這種低用量的試劑由于生產(chǎn)廠家或批次不同，細小的質(zhì)量差異可能會引起使用效果的很大差異。通常的應對措施是減少改換試劑，對新的試劑使用濃度進行梯度實驗，找尋最佳濃度。本實驗兼顧細胞透膜和細胞膜固定強度的調(diào)試，有效地達到抗體透過細胞膜的目的，同時維持細胞的結構穩(wěn)定，防止溶血。對紅細胞的氯通道ClC-3蛋白進行檢測，取得了良好效果。同時，利用本方法可進行其他紅細胞胞膜和胞內(nèi)蛋白等的定位和定量分析。

圖1 激光共聚焦顯微鏡下鼠血細胞熒光ClC-3染色圖像

總之，本研究通過優(yōu)化固定液、透膜液、封閉液和洗滌液，解決了常規(guī)免疫細胞化學法導致紅細胞易溶血的缺點，在確保紅細胞不溶血的同時成功檢測到紅細胞氯通道ClC-3蛋白，即成功建立了一種不溶血的紅細胞免疫熒光細胞化學檢測方法。

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