徐香蘭，韓 冰，鐘啟平，王 麗，燕 杰

(1天津醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，天津300222;2天津市第三中心醫(yī)院;3天津醫(yī)科大學(xué))

舌癌多數(shù)為鱗癌，尤其在舌體前2/3部位的舌癌，常為潰瘍型或浸潤型，一般惡性程度較高，發(fā)病早期易發(fā)生隱匿性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，隱匿性淋巴轉(zhuǎn)移率為20% ～50%［1，2］，患者 5 年生存率一般為 60%，10年以上的生存率更低，治療效果不理想。因此，有關(guān)舌癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的機(jī)制成為了研究的熱點(diǎn)問題。實(shí)體腫瘤中缺氧是一種常見的現(xiàn)象［3］，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是腫瘤缺氧適應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［4］，HIF-1α的高表達(dá)與腫瘤浸潤程度、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后的關(guān)系及其對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響研究較少，尤其是HIF-1α在舌癌細(xì)胞侵襲和遷移中的作用研究甚少，且其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。2010年6月～2012年7月，我們通過RNA干擾技術(shù)降低舌癌細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)，探討HIF-1α在舌癌細(xì)胞侵襲和遷移中的作用及其可能的分子機(jī)制，為抑制舌癌轉(zhuǎn)移尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1．1 材料 ①細(xì)胞株:人舌癌細(xì)胞Tca8113購自美國ATCC細(xì)胞庫。②主要試劑:DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自Hyclone公司;細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning公司;HIF-1α、β-actin與 Fibronectin的抗體購自Santa Cruz公司;E-cadherin、α-SMA 和 vimentin的抗體購自AbCam公司;LipofectamineTM2000脂質(zhì)體、TRIzol試劑購自 Invitrogen公司;CoCl2購自 Sigma公司;ECL試劑盒購自Millipore公司;pGCsi-H1/Hygro/GFPshRNA表達(dá)載體購自上海吉凱公司。

1．2 主要實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 舌癌細(xì)胞Tca8113的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將3個shRNA序列質(zhì)粒導(dǎo)入pGCsi-H1/Hygro/GFPshRNA質(zhì)粒表達(dá)載體(上海吉凱公司)。以下是由吉凱公司設(shè)計合成的3個嵌入載體的shRNA干擾序列(小寫表示插入干擾序列)。Verctor1 91-1:5'-GATCCCgactgatgaccagcaacttgaTTCAAGAGAtcaagttgctggtcatca gtcTTTTTGGAT-3';Verctor2 90-1:5'-GATCCCgcacaggccacattcacgtataTTCAAGAGAtatacgtgaatgtggcctgtgcTTT TTGGAT-3';Verctor3 89-1:5'-GATCCCgaggaagaactatgaacataaTTCAAGAGAttatgttcatagttcttcctcTTTTTGGAT-3'。重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選潮霉素抗性克隆，提取質(zhì)粒，測序法鑒定重組質(zhì)粒，分別定為sh1、sh2、sh3。同時設(shè)置一個陰性對照，即把所設(shè)計的shRNA的核苷酸序列打亂，使其在干擾中不能發(fā)揮作用，用來排除質(zhì)粒載體和與載體相連對其他功能基因的干擾，此為陰性對照質(zhì)粒ctrl。

將人舌癌細(xì)胞Tca8113置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵箱中孵育3 d后，棄去未貼壁細(xì)胞，常氧環(huán)境繼續(xù)孵育。將生長良好的舌癌細(xì)胞Tca8113用胰蛋白酶消化，取細(xì)胞1×105/mL，接種于6孔板，培養(yǎng)至80%融合，在LipofectamineTM2000脂質(zhì)體介導(dǎo)下進(jìn)行HIF-1α shRNA 質(zhì)粒(sh1、sh2、sh3)和陰性對照質(zhì)粒ctrl的轉(zhuǎn)染(分別為siHIF-1α組和空載組)，空白對照孔加入含相同濃度脂質(zhì)體的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，6 h移去含脂質(zhì)體的培養(yǎng)液，換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。半定量RT-PCR和Western blot法確定HIF-1αshRNA干擾效果。選擇轉(zhuǎn)染干擾效果最佳序列的細(xì)胞，加入潮霉素篩選，經(jīng)過6～8周的培養(yǎng)，篩選出表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)且有潮霉素抗性的陽性細(xì)胞克隆株，使用含有潮霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1．2．2 舌癌細(xì)胞Tca8113中HIF-1αmRNA及蛋白的檢測 分別采用半定量RT-PCR和Western blot法。上述各組舌癌細(xì)胞在低氧誘導(dǎo)培養(yǎng)液(加入化學(xué)缺氧劑CoCl2，終濃度為150μmol/L)中培養(yǎng)48 h(空載組分別進(jìn)行常氧培養(yǎng)和低氧培養(yǎng))。Trizol提取細(xì)胞總RNA，取3μg的RNA參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA，HIF-1α上游引物為5'-GGACAAGTCACCACAGGA-3'，下游引物為5'-GGAGAAAATCAAGTCGTG-3'，片段大小168 bp，以β-actin作為內(nèi)參。PCR條件:95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，53．3 ℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)后，72℃繼續(xù)延伸10 min。取5μL的 PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1．5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

采用RIPA法提取舌癌細(xì)胞總蛋白，蛋白定量(BCA法)后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加HIF-1α抗體4℃孵育過夜，洗滌后加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠HIF-1α的二抗，室溫水平振搖1 h后，加入ECL發(fā)光劑顯色，膠片曝光檢查蛋白表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參照。

1．2．3 舌癌細(xì)胞Tca8113的遷移能力檢測 采用劃痕實(shí)驗(yàn)。分別取空載組和siHIF-1α組(轉(zhuǎn)染干擾效果最理想的HIF-1αshRNA質(zhì)粒的細(xì)胞)生長期細(xì)胞1×104/mL，按照一定的密度鋪在35 mm的培養(yǎng)皿中，生長后2 d，在培養(yǎng)皿底部用無菌20μL槍頭劃出比較均勻的劃痕，在不同的時相(3、9、12 h)記錄劃痕的寬度，并計算出細(xì)胞移動的距離。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1．2．4 舌癌細(xì)胞Tca8113侵襲能力檢測 采用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。在冰上將 Matrigel膠與無血清的DMEM培養(yǎng)基以1∶5比例稀釋，然后在12孔transwell小室中每孔滴入120μL，置于37℃溫箱孵育1 h，使基質(zhì)膠凝固。消化重懸取空載組和siHIF-1α(轉(zhuǎn)染干擾效果最理想的HIF-1αshRNA質(zhì)粒的細(xì)胞)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，將400μL細(xì)胞懸液加入transwell上室，800μL含10%血清的培養(yǎng)基加入transwell下室，37℃溫箱孵育48 h后，小心去掉Matrigel膠，擦去未穿過膜的細(xì)胞，4%多聚甲醛(PFA)固定10 min，然后用0．005%結(jié)晶紫染色40 min，200倍顯微鏡下觀察透過膜的細(xì)胞，隨機(jī)取5個視野計數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1．2．5 舌癌細(xì)胞Tca8113上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)標(biāo)志蛋白和黏著斑激酶(FAK)及磷酸化FAK(p-FAK)的檢測 采用 Western blot法。同上述HIF-1α蛋白的檢測，只是針對檢測蛋白的不同，一抗有所區(qū)別，siHIF-1α組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后低氧培養(yǎng)48 h后檢測。以未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的Tca8113作對照(對照組)

1．3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件。兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 HIF-1αshRNA重組質(zhì)粒的電泳結(jié)果 重組后帶有shRNA的質(zhì)粒電泳圖顯示為6 338 bp，說明提取物為所需質(zhì)粒(圖1)。

圖2 舌癌細(xì)胞Tca8113中HIF-1αmRNA及蛋白的表達(dá)

表1 不同培養(yǎng)時間兩組舌癌細(xì)胞Tca8113遷移的距離比較(mm，ˉx ±s)

2．5 舌癌細(xì)胞Tca8113中EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白檢測結(jié)果 與對照組相比，siHIF-1α組E-鈣黏素(E-cadherin)表達(dá)明顯增加，波形蛋白(Vimentin)、纖維黏連蛋白(Fibronectin)、平滑肌動蛋白(α-SMA)表達(dá)明顯減少，見圖3。

圖3 舌癌細(xì)胞Tca8113中EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)

2．6 舌癌細(xì)胞Tca8113中FAK及p-FAK檢測結(jié)果

與對照組相比，siHIF-1α組FAK表達(dá)無明顯變化，但其p-FAK表達(dá)明顯減少，見圖4。

圖4 舌癌細(xì)胞Tca8113中FAK及其p-FAK的表達(dá)

圖1 HIF-1αshRNA重組質(zhì)粒的電泳圖

2．2 HIF-1αshRNA干擾效果 根據(jù)半定量RT-PCR和Western blot法檢測到的舌癌細(xì)胞Tca8113中HIF-1αmRNA及蛋白，轉(zhuǎn)染sh3質(zhì)粒對HIF-1α的干擾效果最理想，可作為成功沉默HIF-1α的序列(圖2)。

2．3 舌癌細(xì)胞Tca8113的遷移能力 空載組和siHIF-1α組培養(yǎng)3、9、12 h舌癌細(xì)胞Tca8113遷移的距離(mm)比較見表1。

2．4 舌癌細(xì)胞Tca8113的侵襲能力 空載組與siHIF-1α組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(67．07 ±2．02)個和(35．20 ±11．42)個，兩組相比，P ＜0．05。

3 討論

腫瘤細(xì)胞對缺氧的適應(yīng)導(dǎo)致其對放化療的抗性增加，而且使其侵襲性表型增加，從而導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。許多因素參與腫瘤細(xì)胞對缺氧微環(huán)境的適應(yīng)及腫瘤細(xì)胞特性改變的調(diào)節(jié)，其中HIF-1α是重要的調(diào)節(jié)因子之一。研究［5］發(fā)現(xiàn)，HIF-1α直接調(diào)控的與缺氧適應(yīng)有關(guān)的下游靶基因有100多個，HIF-1α通過不同的信號通路及機(jī)制調(diào)控腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，如細(xì)胞糖酵解、促血管生成及細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等過程。為進(jìn)一步探討HIF-1α在腫瘤的生物學(xué)進(jìn)程及其信號通路中的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾技術(shù)將HIF-1αshRNA表達(dá)載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到舌癌細(xì)胞Tca8113中，觀察HIF-1α表達(dá)下降對舌癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，空載組細(xì)胞明顯向劃痕的中間遷移生長，而siHIF-1α組細(xì)胞的遷移能力顯著減弱;空載組的Tca8113細(xì)胞穿透Matrigel膠的能力也明顯高于siHIF-1α組。表明HIF-1α表達(dá)下降明顯抑制了舌癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

有研究［6］表明，盡管HIF-1α通過調(diào)節(jié)自身代謝和促進(jìn)血管的生成在一定程度上緩解腫瘤細(xì)胞對缺氧的耐受，但腫瘤細(xì)胞最終還是會離開原位向氧和營養(yǎng)供給充足的部位轉(zhuǎn)移，而腫瘤細(xì)胞進(jìn)行EMT是腫瘤實(shí)現(xiàn)侵襲的必要條件［7］。EMT使細(xì)胞喪失上皮表型，如E-cadherin、角蛋白絲，同時獲得間質(zhì)表型，如 Vimentin、Fibronectin、α-SMA、N-鈣黏素等。腫瘤細(xì)胞通過EMT擺脫細(xì)胞之間的連接，從而獲得突破基底膜、侵襲周圍組織的能力［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，siHIF-1α組E-cadherin表達(dá)明顯增加，Vimentin、Fibronectin、α-SMA表達(dá)明顯減少，表明沉默HIF-1α基因表達(dá)可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的EMT表型，即抑制上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象，從而抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。Chen等［9］研究發(fā)現(xiàn)，HIF與 Notch信號通路的靶基因HES1的啟動子相結(jié)合可誘導(dǎo)乳腺癌EMT發(fā)生，這與本研究結(jié)果一致。當(dāng)然，HIF-1α不是與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的惟一調(diào)控基因，并且細(xì)胞對低氧的反應(yīng)及Notch信號通路的相互調(diào)節(jié)也非常復(fù)雜，其相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。研究［10］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK在許多腫瘤中過表達(dá)，通過多條信號通路調(diào)控細(xì)胞侵襲、遷移、增殖及凋亡等，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，尤其對于整合素介導(dǎo)的血液循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的黏附及轉(zhuǎn)移非常重要［11，12］。FAK 的主要調(diào)節(jié)方式是依賴整合素和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，從而促進(jìn)其自身磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動。本研究中siHIF-1α組的FAK表達(dá)無明顯變化，但其P-FAK表達(dá)顯著下降。表明通過抑制HIF-1α的基因表達(dá)，可影響FAK自身磷酸化，在一定程度上可以逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性表型。

RNA干擾沉默HIF-1α基因能有效地抑制舌癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，具有明顯降低舌癌細(xì)胞惡性表型的作用。因此，抑制HIF-1α基因的表達(dá)可能為抗舌癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供一個新的靶位。

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