方 波 趙 曦 王 赫 孫學(xué)軍 馬 虹

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，沈陽(yáng) 110001）

胸腹主動(dòng)脈手術(shù)通常需要阻斷主動(dòng)脈，造成脊髓缺血再灌注損傷，引起截癱［1］。盡管人們已做了大量研究來(lái)防治脊髓缺血，但至今仍未取得令人滿(mǎn)意的效果。如何提高脊髓自身的抗損傷能力引起了國(guó)內(nèi)外有關(guān)學(xué)者的關(guān)注。缺血預(yù)處理（Ischemic precondi－tioning，IPC）是通過(guò)短暫缺血使該組織耐受隨后長(zhǎng)時(shí)間缺血的現(xiàn)象。研究表明IPC能夠有效的保護(hù)缺血脊髓［2，3］。迄今為止，IPC治療脊髓缺血再灌注損傷的機(jī)制研究集中在熱休克蛋白合成［1］，腺苷［4］和牛磺酸釋放［5］，增加局部血流［6］，激活神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子［7］及抗凋亡［3］等方面。組織水腫是脊髓缺血再灌注損傷的主要繼發(fā)性病理改變。水通道蛋白－4（apuaporin－4，AQP－4）主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)［8］，在腦和脊髓的許多生理及病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［9］。本研究擬探討IPC對(duì)兔脊髓缺血再灌注損傷后AQP－4表達(dá)的影響，闡明其脊髓保護(hù)的機(jī)制。

材料和方法

1.動(dòng)物選擇及分組

成年日本大耳白兔72只，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重1.8－2.6kg。采用隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為3組（n＝24）：假手術(shù)組（S組）、脊髓缺血再灌注組（I/R組）和缺血預(yù)處理組（IPC組），每組設(shè)兩個(gè)觀察時(shí)點(diǎn)，分別是損傷后4h和24h。S組打開(kāi)腹腔暴露游離腎下腹主動(dòng)脈，但不阻斷；I/R組阻斷腹主動(dòng)脈30min造成脊髓缺血再灌注損傷；IPC組短暫阻斷腹主動(dòng)脈5min，灌注10min，再阻斷5min，灌注25min實(shí)施預(yù)處理，之后阻斷腹主動(dòng)脈30min造成缺血再灌注損傷。

2.脊髓缺血再灌注模型的建立

兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦（1g/kg）麻醉，保留自主呼吸。耳緣中動(dòng)脈置管測(cè)量近端動(dòng)脈血壓，股動(dòng)脈置管測(cè)量遠(yuǎn)端血壓。直腸內(nèi)置入溫度傳感器，持續(xù)監(jiān)測(cè)體溫，應(yīng)用電熱毯維持核心溫度38℃左右。腹部皮膚剪毛后消毒，取腹正中切口，沿腹白線0.25%布比卡因局部浸潤(rùn)，剪開(kāi)腹壁肌肉，暴露左腎及腹主動(dòng)脈，用組織鉗鈍性分離左腎下腹主動(dòng)脈。全身肝素化（200U/kg）后，腎動(dòng)脈下1cm處用無(wú)損傷動(dòng)脈夾阻斷腹主動(dòng)脈30min，以遠(yuǎn)端平均動(dòng)脈壓（MAP）低于20mmHg為完全阻斷的標(biāo)準(zhǔn)。之后撤動(dòng)脈夾開(kāi)放腹主動(dòng)脈，造成脊髓缺血再灌注損傷。之后絲線縫合，回籠飼養(yǎng)。

3.神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)

以改良的Tarlov評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)下肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，沒(méi)有可覺(jué)察的下肢活動(dòng)；1分，有可覺(jué)察的關(guān)節(jié)自主活動(dòng)；2分，后肢可自由活動(dòng)但無(wú)法站立；3分，可站立但無(wú)法行走；4分，后肢功能完全恢復(fù)，能正常行走。

4.脊髓水腫測(cè)定

采用干濕法測(cè)定脊髓含水量，評(píng)價(jià)脊髓水腫。分別取新鮮脊髓缺血節(jié)段（L4－6）標(biāo)本用濾紙吸除表面水分后，置于電子天平稱(chēng)取濕重 （W），再經(jīng)110℃恒溫烤箱烘烤24h后稱(chēng)取干重（D）。應(yīng)用公式：脊髓含水量 （%）＝ （W－D）/W×100，計(jì)算脊髓含水量。

5.脊髓組織AQP－4表達(dá)的測(cè)定

取脊髓缺血節(jié)段，以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取12張切片，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。一抗為兔抗AQP－4多克隆抗體，由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察染色積分光密度（integrated optical density，IOD），取均值為該樣本脊髓的 AQP－4染色I(xiàn)OD。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

動(dòng)物均于術(shù)后2h內(nèi)蘇醒，各組分別于脊髓缺血再灌注損傷后4h和24h按照Talov評(píng)分進(jìn)行評(píng)估。與S組相比，I/R組和IPC組損傷后4h和24h Talov評(píng)分組均明顯降低（P＜0.01），與I/R組相比IPC組損傷后4h和24hTalov評(píng)分均增高（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 各組脊髓缺血再灌注損傷后4h、24h神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分（n＝12）Fig.1 Tarlov score at 4hand 24hafter spinal ischemiareperfusion injury（±s，n＝12）＊P＜0.01vs S group，＃P＜0.01vs I/R group

2.脊髓含水量

脊髓缺血再灌注損傷后4h脊髓含水量即有明顯增加（P＜0.01），24h增加更多（P＜0.01）；與I/R組相比，IPC組損傷后4h和24h脊髓含水量均明顯減少（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組脊髓缺血再灌注損傷后4h、24h脊髓組織含水量（n＝6，±s）Table1 Spinal water content at 4hand 24hafter spinal ischemia－reperfusion injury（n＝6，±s）

表1 各組脊髓缺血再灌注損傷后4h、24h脊髓組織含水量（n＝6，±s）Table1 Spinal water content at 4hand 24hafter spinal ischemia－reperfusion injury（n＝6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs S group，＃＃P＜0.01vs I/R group

S I/R IPC 4h61.84±1.52 68.95±1.84＊＊ 64.15±1.59＊＃＃24h61.65±1.13 75.12±2.47＊＊ 67.92±1.76＊＊＃＃

3.脊髓組織中AQP－4表達(dá)

AQP－4主要分布在毛細(xì)血管周?chē)男切湍z質(zhì)細(xì)胞膜表面及終足上，還見(jiàn)于軟脊膜細(xì)胞，脊髓中央管的室管膜細(xì)胞表面。脊髓損傷后4hAQP－4IOD較假手術(shù)組顯著增加（P＜0.05），24h增加更顯著（P＜0.01）；與I/R組相比，IPC組損傷后4h和24h AQP－4IOD明顯減少（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 各組脊髓缺血再灌注損傷后脊髓組織AQP－4表達(dá)（n＝6，±s）。（A）脊髓組織AQP－4免疫組化染色。a：S組（×100）；b：S組（×200）；c：I/R組24h（×100）；d：I/R組24h（×200）；e：IPC組24h（×100）；f：IPC組24h（×200）；g：S組全景分布（×25）。（B）AQP－4染色I(xiàn)OD值。Fig.2 AQP－4expression at 4hand 24hafter spinal ischemia－reperfusion injury（n＝6，±s）.（A）Representative immunostaining of AQP－4in spinal cords.a：S group（×100）；b：S group（×200）；c：I/R 24h（×100）；d：I/R 24h（×200）；e：IPC 24h（×100）；f：IPC 24h（×200）；g：distribution of overall view in S group（×25）.（B）Quantitative analysis of AQP－4IOD.

討 論

脊髓缺血再灌注損傷是去除導(dǎo)致脊髓缺血的因素后，脊髓恢復(fù)血供，但神經(jīng)功能不僅沒(méi)有改善，反而在原來(lái)缺血損傷的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加重，甚至出現(xiàn)不可逆性脊髓神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的現(xiàn)象［10］。缺血/再灌注損傷機(jī)制十分復(fù)雜，雖然有些藥物或處理措施對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有效，但能成功應(yīng)用于臨床的仍然很少。自從IPC應(yīng)用于心肌保護(hù)，很多學(xué)者致力于研究IPC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的保護(hù)作用。IPC包括早期預(yù)處理和延遲預(yù)處理兩種保護(hù)作用。早期IPC是在短暫缺血后幾分鐘至幾小時(shí)內(nèi)提高缺血耐受性，而延遲IPC則是在短暫缺血后一天或幾天發(fā)揮有益的作用。本研究發(fā)現(xiàn)IPC在脊髓缺血再灌注損傷后4h和24h抑制AQP－4表達(dá)，減輕脊髓水腫，并改善神經(jīng)功能，可能是分別通過(guò)早期保護(hù)和延遲保護(hù)的作用機(jī)制。

水通道蛋白（apuaporins，AQPs）是近十余年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一組膜通道蛋白，廣泛存在于各種生物的細(xì)胞膜上，介導(dǎo)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)血腦屏障對(duì)水分子、K＋的通透和神經(jīng)細(xì)胞外間隙的大小。其中，AQP－4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后血腦屏障的破壞和組織水腫的形成過(guò)程中起重要作用，而它的缺失可減輕水中毒和局部缺血所引起的水腫癥狀［11］。研究表明各種大腦損傷都導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞AQP－4mRNA的高表達(dá)，加重?fù)p傷區(qū)及其周?chē)课凰[［12］，而 AQP－4表達(dá)的下調(diào)可在滲透壓梯度和靜水壓促進(jìn)水進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)時(shí)降低血腦屏障對(duì)水的通透性，防止腦水腫的發(fā)生［13，14］。研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后1dAQP－4及其mRNA表達(dá)開(kāi)始增加，脊髓損傷后3d達(dá)高峰，相應(yīng)的水腫形成［15］，因此推斷AQP－4表達(dá)增加可能是促使脊髓組織水腫發(fā)生的重要因素之一。但也有研究持相反的觀點(diǎn)，Joshi等［16］認(rèn)為脊髓損傷時(shí)血管性水腫是過(guò)多的水分可能通過(guò)受損的血脊髓屏障進(jìn)入細(xì)胞外間隙，而不依賴(lài)AQP－4。本研究采取經(jīng)典的阻斷腹主動(dòng)脈的方法制備脊髓缺血再灌注損傷模型，結(jié)果表明脊髓缺血再灌注損傷后AQP－4表達(dá)增加，脊髓出現(xiàn)水腫，神經(jīng)功能降低，相比之下IPC組AQP－4表達(dá)增加受到抑制，脊髓水腫減輕，神經(jīng)功能改善。其他的研究［17－19］同樣發(fā)現(xiàn)應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和嗅鞘細(xì)胞移植或中藥治療脊髓損傷也可通過(guò)抑制AQP－4表達(dá)，消除脊髓水腫，減輕脊髓繼發(fā)性損傷，從而保存殘存的脊髓組織并促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)，支持本研究的結(jié)果。

綜上所述，IPC能通過(guò)抑制脊髓損傷后AQP－4的表達(dá)，減輕脊髓損傷部位水腫、減輕脊髓缺血再灌注損傷，這可能是IPC脊髓保護(hù)的機(jī)制之一。

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