錢(qián)小成 李曉飛 劉正亮 潘紅春

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重要生物資源保護(hù)與利用研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蕪湖 241000）

淡水水螅是常見(jiàn)的兩胚層低等動(dòng)物，由于其具備在實(shí)驗(yàn)室易培養(yǎng)以及無(wú)性繁殖速度非?？斓葍?yōu)點(diǎn)，因此水螅已成為在進(jìn)化生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和動(dòng)物再生等研究領(lǐng)域具有較高科研價(jià)值的模式生物［1，2］。水螅具有簡(jiǎn)單的單個(gè)體軸的極性體制，一個(gè)極為由口、垂唇和口周?chē)臄?shù)根觸手組成的口區(qū)，另一極為由柄和位于身體末端的基盤(pán)構(gòu)成的足區(qū)，口區(qū)和足區(qū)之間為胃區(qū)，其中胃區(qū)與柄的分界處為出芽區(qū)。在野外自然水體中，水螅依靠基盤(pán)吸附于水中物體如水生植物的表面，其身體另外一端即水螅頭部口周?chē)挠|手得以自然延長(zhǎng)下垂“守株待兔”式地捕食水中快速運(yùn)動(dòng)的小型無(wú)脊椎動(dòng)物，因此位于身體末端的基盤(pán)作為固著器官在水螅生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用［3，4］?；P(pán)組織的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞組成及相關(guān)生理生化指標(biāo)已較為明確［5－9］，但基盤(pán)的固著機(jī)理及保持基盤(pán)組織的形態(tài)學(xué)完整性（基盤(pán)在附著和脫離水中支持物表面的過(guò)程中形態(tài)結(jié)構(gòu)易受到破壞）的細(xì)胞學(xué)機(jī)制等方面仍未定論。

本研究室由于實(shí)驗(yàn)需要經(jīng)常在高頻喂食的條件下規(guī)?；囵B(yǎng)水螅，在大批量水螅個(gè)體中偶然發(fā)現(xiàn)一些水螅個(gè)體出現(xiàn)更新基盤(pán)組織的現(xiàn)象，這個(gè)現(xiàn)象暗示水螅的營(yíng)養(yǎng)積累可能是水?；P(pán)組織更新的誘因。基于此，本文為探討水螅營(yíng)養(yǎng)積累與基盤(pán)組織更新進(jìn)程間的相關(guān)性，系統(tǒng)地觀察了不同喂食頻率條件下水螅更新基盤(pán)組織的進(jìn)程，為進(jìn)一步研究水?；P(pán)保持形態(tài)學(xué)完整性的細(xì)胞學(xué)機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用水螅為本實(shí)驗(yàn)室培育的大乳頭水螅（Hydramagnipapillata）單克隆無(wú)性繁殖系，原種采自安徽省蕪湖市汀堂公園水塘（31。21’39.2”N，118。22’51.46”E）。實(shí)驗(yàn)前水螅每3d喂食一次鹵蟲(chóng)幼體（Artemia sp.），喂食1h后更換培養(yǎng)液，然后維持在溫度22±0.5℃的光照培養(yǎng)箱中（光照強(qiáng)度＝2000LX，LD：HD＝12h∶12h）。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1 喂食頻率與基盤(pán)更新進(jìn)程相關(guān)性實(shí)驗(yàn)

挑取體長(zhǎng)1.5cm左右且無(wú)芽體的水螅個(gè)體用于本實(shí)驗(yàn)。共分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組的喂食頻率分別為1天喂1次、1天喂2次、1天喂3次、1天喂4次和1天喂5次。所有實(shí)驗(yàn)在溫度22±0.5℃、光照度2000LX以及光周期亮暗比12h∶12h的條件下進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組20只水螅，每只水螅單獨(dú)放在0.5L玻璃燒杯中培養(yǎng)，此后每隔24h通過(guò)Olympus數(shù)碼顯微鏡觀察和記錄。每次喂食后均清污換水，所用水為除氯曝氣并充氧的自來(lái)水。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行了40d。

2.2 基盤(pán)分子標(biāo)志物基盤(pán)過(guò)氧化物酶表達(dá)的檢測(cè)

通過(guò)ABTS細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)水?；P(pán)分子標(biāo)志物過(guò)氧化物酶的表達(dá)，觀察水?；P(pán)組織是否形成。ABTS細(xì)胞化學(xué)染色法的基本原理是反應(yīng)液中的ABTS和H2O2均能一定程度地穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的過(guò)氧化物酶可使H2O2分解為水和活性氧，而活性氧進(jìn)一步氧化ABTS使之由還原態(tài)時(shí)的淡藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸瘧B(tài)時(shí)的紫紅色，就這樣表達(dá)過(guò)氧化物酶的細(xì)胞被染成紫紅色［2－3］。將水螅置于白色陶瓷比色板上（每孔1只水螅），每孔分別加入350μl新鮮配制的ABTS染色混合液（655mmol/L檸檬酸、345mmol/L檸檬酸鹽和1%ABTS溶液各700μl，70μl 0.3%H2O2，雙蒸水定容至7ml）［4］，反應(yīng)20min后用雙蒸水洗滌2次，加入300μl 2%NaF溶液，然后通過(guò)Olympus數(shù)碼顯微鏡觀察和拍照。

結(jié) 果

1.水螅更新基盤(pán)組織進(jìn)程中的形態(tài)學(xué)變化

不同喂食頻率下水螅更新基盤(pán)組織的時(shí)間進(jìn)程雖有差異，但其形態(tài)學(xué)進(jìn)程卻類似（圖1）。維持一定的喂食頻率一段時(shí)間后，水螅在出芽區(qū)逐漸出現(xiàn)數(shù)個(gè)芽體（圖1B－C），成熟芽體不斷脫落，新生芽體不斷出現(xiàn)，若干天后在出芽區(qū)和基盤(pán)之間靠近芽體的位置出現(xiàn)縊痕（圖1D－F），最后水螅體在縊痕處斷裂為水螅體主體和老基盤(pán)組織兩部分（圖1G）。

圖1 1d喂3次實(shí)驗(yàn)組水螅更新基盤(pán)組織進(jìn)程中的形態(tài)學(xué)變化.1d（A，10×），3d（B，10×），5d（C，10×），14d（D，10×），21d（E，10×），縊痕斷裂前基盤(pán)過(guò)氧化物酶的表達(dá)（F，30×），23d時(shí)縊痕斷裂（G，6×），縊痕斷裂12h后的老基盤(pán)組織（H，15×），縊痕斷裂48h后的老基盤(pán)組織（I，10×），縊痕斷裂72h后的老基盤(pán)組織（J，10×），縊痕斷裂3d后水螅體主體（K，10×），縊痕斷裂15d后水螅體主體（L，10×），縊痕斷裂15d后水螅體主體傷口處過(guò)氧化物酶表達(dá)的檢測(cè)（M，20×），BBP（芽體基盤(pán)組織過(guò)氧化物酶的表達(dá)），BD（基盤(pán)），BR（出芽區(qū)），BU（芽體），CO（縊痕），M（口），OBD（老基盤(pán)組織），OBP（老基盤(pán)組織過(guò)氧化物酶的表達(dá)），PP（水螅體主體），T（觸手），WO（縊痕斷裂后的傷口）Fig.1 The morphological process of hydra renewing basal disc under the feeding frequency of thrice daily.1d（A，10×），3d（B，10×），5d（C，10×），14d（D，10×），21d（E，10×），the expression of peroxidase in the basal disc before the hydra broke into two parts at the constriction（F，30×），the hydra broke into two parts at the constriction after 23days under the feeding frequency of thrice daily（G，6×），old basal disc tissue at 12hafter the hydra broke into two parts at the constriction（H，15×），old basal disc tissue at 48hafter the hydra broke into two parts at the constriction（I，10×），old basal disc tissue at 72hafter the hydra broke into two parts at the constriction（J，10×），the parent polyp at 3dafter the hydra broke into two parts at the constriction（K，10×），the parent polyp at 15dafter the hydra broke into two parts at the constriction（L，10×），the detection of peroxidase expression in the wound of parent polyp at 15dafter the hydra broke into two parts at the constriction（M，20×），BBP（the expression of peroxidase in the basal disc of bud），BD（basal disc），BR（budding region），BU（bud），CO（constriction），M （mouth），OBD（old basal disc tissue），OBP（the expression of peroxidase in the old basal disc tissue），PP（parent polyp），T（tentacle），WO（wound）

2.喂食頻率對(duì)基盤(pán)更新進(jìn)程的影響

喂食頻率對(duì)水?；P(pán)更新進(jìn)程的影響較為明顯（表1），實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到40d時(shí)，1天喂5次、1天喂4次、1天喂3次和1天喂2次實(shí)驗(yàn)組中的每個(gè)水螅個(gè)體在芽體下方均出現(xiàn)了縊痕，但1天喂1次實(shí)驗(yàn)組僅有70%的個(gè)體在芽體下方出現(xiàn)縊痕。另外，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到40天時(shí)各實(shí)驗(yàn)組縊痕最終斷裂的水螅個(gè)體數(shù)差異明顯，1天喂4次、1天喂3次和1天喂2次實(shí)驗(yàn)組中70%以上的個(gè)體縊痕斷裂，1天喂5次實(shí)驗(yàn)組50%的個(gè)體縊痕斷裂，而1天喂1次實(shí)驗(yàn)組總共20只個(gè)體中只有3只縊痕斷裂。

?

3.脫落的老基盤(pán)組織的兩種命運(yùn)

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到40d時(shí)從所有實(shí)驗(yàn)組得到的共約60只脫落的老基盤(pán)組織在縊痕斷裂后獨(dú)立發(fā)育時(shí)呈現(xiàn)兩種不同的命運(yùn)，其中約1/3的老基盤(pán)組織的傷口再生出頭部、直至發(fā)育成正常的水螅個(gè)體（圖1H－J），其頭部再生時(shí)間進(jìn)程與水螅頭部人工切除手術(shù)后頭部再生時(shí)間進(jìn)程基本相似［2］；而另外約2/3的老基盤(pán)組織在縊痕斷裂后獨(dú)立發(fā)育時(shí)逐漸收縮和萎縮，其傷口處不能發(fā)育成頭部，直至1w后解體（圖2）。

4.老基盤(pán)組織脫落后水螅體主體新基盤(pán)組織的再生

縊痕斷裂后對(duì)水螅體主體保持既定的喂食頻率，其斷裂傷口能愈合但不能再生出新的基盤(pán)組織（圖1K－L），這個(gè)結(jié)論有兩個(gè)重要依據(jù)，其一是愈合的傷口處（該部位本應(yīng)再生出新生基盤(pán)組織）一直無(wú)固著能力；其二是愈合的傷口處未能檢測(cè)出基盤(pán)特異性過(guò)氧化物酶（基盤(pán)分子標(biāo)志物）的表達(dá)（圖1M）。喂食頻率降低到3天喂1次后，傷口上方的芽體逐漸脫落（圖3C－F），直至其傷口上方的芽體全部脫落后愈合的傷口處再生出新生基盤(pán)組織（圖3G－H）。

圖2 1天喂3次實(shí)驗(yàn)組1例水螅個(gè)體更新基盤(pán)組織進(jìn)程中的形態(tài)學(xué)變化.1d（A，10×），5d（B，15×），縊痕斷裂12h后的老基盤(pán)組織（C，20×），縊痕斷裂4d后的老基盤(pán)組織（D，20×），縊痕斷裂6d后的老基盤(pán)組織（E，20×），縊痕斷裂8d后的老基盤(pán)組織已分解（F，200×），CO（縊痕），PP（水螅體主體）Fig.2 The morphological process of hydra renewing basal disc under the feeding frequency of thrice daily.1d（A，10×），5d（B，15×），old basal disc tissue at 12hafter the hydra broke into two parts at the constriction（C，20×），old basal disc tissue at 4dafter the hydra broke into two parts at the constriction（D，20×），old basal disc tissue at 6dafter the hydra broke into two parts at the constriction（E，20×），old basal disc tissue at 8dafter the hydra broke into two parts at the constriction（F，200×），CO（constriction），PP（parent polyp）

圖3 縊痕斷裂后水螅體主體傷口處新基盤(pán)組織的再生.1天喂3次進(jìn)行到16d（A，10×），1天喂3次進(jìn)行到24d（B，10×），縊痕斷裂后降低喂食頻率（降低到3天喂1次）第2d水螅體主體（C，10×），縊痕斷裂后降低喂食頻率第3d水螅體主體（D，10×），縊痕斷裂后降低喂食頻率第4d水螅體主體（E，10×），縊痕斷裂后降低喂食頻率第6d水螅體主體（F，10×），縊痕斷裂后降低喂食頻率第6d水螅體主體再生的新基盤(pán)組織吸附在玻片表面的形態(tài)（G，300×），縊痕斷裂后降低喂食頻率第6d水螅體主體再生的新基盤(pán)組織過(guò)氧化物酶的表達(dá)（H，250×），BD（基盤(pán)），CO（縊痕），CZ（不與玻片表面接觸的基盤(pán)中央?yún)^(qū)域），NBP（新基盤(pán)組織過(guò)氧化物酶的表達(dá)），OBD（老基盤(pán)組織），PP（水螅體主體），PS（基盤(pán)組織周邊區(qū)域伸出的偽足），PZ（基盤(pán)組織固著于玻片表面的周邊區(qū)域），WO（縊痕斷裂后的傷口）Fig.3 New basal disc regeneration of parent polyp after the hydra broke into two parts at the constriction.16dunder the feeding frequency of thrice daily（A，10×），24dunder the feeding frequency of thrice daily（B，10×），2dunder the lower feeding frequency of once every three days（C，10×），3dunder the lower feeding frequency of once every three days（D，10×），4dunder the lower feeding frequency of once every three days（E，10×），6dunder the lower feeding frequency of once every three days（F，10×），new basal disc attaching to glass slide（G，300×），the expression of peroxidase in the new basal disc of parent polyp（H，250×），BD（basal disc），CO（constriction），CZ（central zone of new basal disc），NBP（the expression of peroxidase in the new basal disc of parent polyp），OBD（old basal disc），PP（parent polyp），PS（pseudopod），PZ（perimeter zone of new basal disc），WO（wound）

討 論

研究發(fā)現(xiàn)的淡水水螅更新基盤(pán)組織的特殊現(xiàn)象以前在刺胞動(dòng)物門(mén)水螅綱動(dòng)物中未見(jiàn)報(bào)道，其生物學(xué)意義值得深入探討［10］。從水螅體本體脫落的老基盤(pán)組織的兩種不同的命運(yùn)（大部分的老基盤(pán)組織不能發(fā)育成正常水螅體、最終解體；而小部分的老基盤(pán)組織能發(fā)育成正常水螅體）折射出水螅更新基盤(pán)組織的生物學(xué)意義可能是多元的。在自然水體中水螅憑借其基盤(pán)附著在水中的植物或其他物體的表面，同時(shí)基盤(pán)表面上皮細(xì)胞還可伸出偽足而使身體沿著支持物慢慢移動(dòng)，有時(shí)基盤(pán)也可脫離原來(lái)的支持物、進(jìn)而轉(zhuǎn)移到其他支持物上［4］。水?；P(pán)在附著、脫離支持物的過(guò)程中其細(xì)胞結(jié)構(gòu)容易受到損傷，這可能是水螅更新基盤(pán)組織的內(nèi)在動(dòng)因。

然而，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，也有一部分從水螅體本體脫落的老基盤(pán)組織正常發(fā)育成新生水螅，似乎水螅更新基盤(pán)的現(xiàn)象是一種無(wú)性生殖形式，特別是水螅斷裂前在出芽區(qū)和基盤(pán)之間靠近芽體位置出現(xiàn)的縊痕（圖1D－F）提示這種更新基盤(pán)的過(guò)程是一種無(wú)性橫裂生殖。較低喂食頻率（1天喂1次）實(shí)驗(yàn)組縊痕最終斷裂的水螅個(gè)體數(shù)量很少、而其他實(shí)驗(yàn)組（1天喂2－5次）縊痕最終斷裂的水螅個(gè)體數(shù)量較多（表1），喂食頻率其實(shí)代表水螅營(yíng)養(yǎng)積累水平［11］，因此本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)際上反映的是較高營(yíng)養(yǎng)積累水平能促進(jìn)水螅更新基盤(pán)組織。較高營(yíng)養(yǎng)水平首先促進(jìn)水螅出芽生殖（圖1C，圖3A），在出芽區(qū)下方縊痕產(chǎn)生之前出芽區(qū)一直保持?jǐn)?shù)個(gè)芽體（存在的芽體是動(dòng)態(tài)的，成熟芽體不斷脫落，新生芽體不斷出現(xiàn)），這種高頻率的無(wú)性出芽生殖持續(xù)一段時(shí)間后在出芽區(qū)下方開(kāi)始出現(xiàn)縊痕。水螅個(gè)體大小是一定的，高營(yíng)養(yǎng)積累水平刺激細(xì)胞分裂，最終以出芽生殖的形式保持水螅體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)平衡，因此高頻率的無(wú)性出芽生殖維持相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間后在出芽區(qū)和基盤(pán)之間靠近芽體的位置橫斷為前、后兩個(gè)部分（水螅體本體及老基盤(pán)組織）可能是水螅在較高喂食頻率下保持體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)平衡的另外一種補(bǔ)充方式。總之，本文首次觀察到的淡水水螅在出芽區(qū)和基盤(pán)之間的橫斷現(xiàn)象可以歸納為除出芽生殖外的第二種無(wú)性生殖方式，并且較高營(yíng)養(yǎng)積累水平能刺激這種無(wú)性橫裂生殖的發(fā)生。

另外，研究還發(fā)現(xiàn)縊痕斷裂后對(duì)水螅體主體保持既定的喂食頻率，其斷裂傷口能愈合但不能再生出新的基盤(pán)組織；對(duì)其降低喂食頻率直至其傷口上方的芽體全部脫落后斷裂傷口處才開(kāi)始啟動(dòng)產(chǎn)生新的基盤(pán)組織，這說(shuō)明傷口附近的芽體抑制了該處新生基盤(pán)的再生。無(wú)獨(dú)有偶，金燦等通過(guò)人工手術(shù)在水螅芽體下方緊貼芽體的位置把水螅切割為前后兩個(gè)部分［12］，手術(shù)后身體前段傷口處不能馬上啟動(dòng)基盤(pán)再生機(jī)制，即使芽體脫離母體后仍然有相當(dāng)數(shù)量的身體前段傷口不能再生出新生基盤(pán)。芽體抑制傷口處基盤(pán)組織再生的機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

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