程 坤，胡治平

腦功能在缺血再灌注（I／R）后出現(xiàn)嚴(yán)重的障礙，稱之為腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷是多種因素相互作用的結(jié)果［1］，其機(jī)制可能包括：自由基生成增多、內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、前列腺素增高、蛋白酶的激活、細(xì)胞因子產(chǎn)生增加和興奮性氨基酸釋放過度等諸因素。近些年來，關(guān)于小熱休克蛋白（small heat shock protein，sHSP）和胰島素樣生長因子－1（insulin－like growth factor，IGF－1）與腦缺血性損傷的研究日益受到關(guān)注。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立 將北京動物實驗研究中心提供的健康雄性蒙古沙鼠（體重90g±10g），隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、I／R6h組、I／R1d組、I／R3d組、I／R7d組。對于I／R組用戊巴比妥（30mg／kg）腹腔麻醉后，迅速分離并暴露雙側(cè)的頸總動脈，夾閉10min后恢復(fù)血流，然后按照分組于6h、1d、3 d、7d后斷頭處死動物。

1.2 主要試劑 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供的HSP27和IGF－1兔多克隆抗體，SP免疫組織化學(xué)試劑盒以及DAB顯色試劑盒。

1.3 病理變化、免疫組織化學(xué)染色法的觀察 行常規(guī)HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察海馬CA1區(qū)的病理變化。采用免疫組織化學(xué)SP法檢測腦組織中HSP27、IGF－1的表達(dá)，陽性為細(xì)胞質(zhì)見棕褐色細(xì)顆粒。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用LSD－t檢驗法、直線相關(guān)分析法；統(tǒng)計分析使用SPSS Ver.15.0軟件完成。

2 結(jié) 果

2.1 病理觀察結(jié)果 隨再灌注時間延長可見膠質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)水腫、肥大、增生，神經(jīng)元壞死，以缺血再灌注3d、7d組損傷較重。

2.2 免疫組化結(jié)果 陽性為細(xì)胞質(zhì)見棕褐色細(xì)顆粒，在正常對照組及假手術(shù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），兩組前腦皮質(zhì)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中HSP 2 7和IGF－1有少量表達(dá)。在I／R6h組HSP27和IGF－1的表達(dá)開始增加，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；I／R3d組呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，表達(dá)達(dá)到高峰；與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；I／R7d組表達(dá)雖較前減少，但仍高于假手術(shù)組（P＜0.05）。I／R各組間表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在相同誘發(fā)條件下，HSP27和IGF－1在前腦皮質(zhì)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)一致，直線相關(guān)分析表明表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.848，P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組Hsp 27和IGF－1陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)（x±s）

3 討 論

HSP27是在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的分子量為27kD的小熱休克蛋白。在生理情況下HSP27主要以組成型即非磷酸化形式在腦干和脊髓細(xì)胞胞漿中表達(dá)，腦皮質(zhì)細(xì)胞中有少量表達(dá)［2］。HSP27在神經(jīng)細(xì)胞處于缺血缺氧狀態(tài)、癲癇發(fā)作、過高體溫等應(yīng)激狀況時被誘導(dǎo)，在絲氨酸位點(diǎn)上磷酸化，形成磷酸化的異構(gòu)體，在腦皮質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)增加，從而發(fā)揮其分子伴侶細(xì)胞保護(hù)作用。

Kazuhiko等［3］研究表明缺血再灌注1，HSP27在沙鼠海馬齒狀回的表達(dá)開始增加，至2d～4d達(dá)到高峰；而如果夾閉時間延長至6分～8.5分，則還可見CAI區(qū)表達(dá)HSP27。本實驗與上述的實驗結(jié)果相似?？赡艿脑蚴牵阂恍┯泻?xì)胞因子在缺血再灌注后其表達(dá)開始上調(diào)，從而激活轉(zhuǎn)錄因子HSF，與HSE結(jié)合并啟動HSP27的基因，從而使磷酸化的HSP27表達(dá)上調(diào)［4］，并發(fā)揮其分子伴侶、抑制細(xì)胞凋亡、抗炎等細(xì)胞保護(hù)作用。

IGF－1是一類廣泛存在于機(jī)體多種組織中的小分子蛋白多肽，分子量約為7 500kD，IGF－1在腦組織中廣泛分布。IGF－1主要以與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（IGFBPs）結(jié)合存在，游離IGF－1與結(jié)合IGF－1可以互相轉(zhuǎn)化。IGF－1的大部分細(xì)胞效應(yīng)是通過IGF－1受體實現(xiàn)的［5］。IGF－1在正常腦組織可促進(jìn)正常生長和腦的發(fā)育。一些研究表明，IGF－1內(nèi)源性水平被上調(diào)在缺血再灌注的腦組織中，從而調(diào)節(jié)內(nèi)源性的修復(fù)和保護(hù)機(jī)制［6］。

Hwang等［7］觀察到腦缺血早期（1 2h～2 4h）內(nèi)源性IGF–1在海馬、齒狀回神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增加，且與抑制遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡有關(guān)。在本實驗得出一致的結(jié)論。IGF－1保護(hù)缺血性腦損傷的可能機(jī)制有：降低腦血管阻力、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、對抗興奮性氨基酸毒性、防止細(xì)胞的鈣超載、調(diào)節(jié)一氧化氮合酶活性等［6］。此外在缺血性腦損傷中IGF－1的合成增多，還參與神經(jīng)元的修復(fù)和再生。

HSP27與IGF－1在腦缺血再灌注損傷中的關(guān)系國內(nèi)外尚無研究。李旺輝［8］觀察到，在注入IGF－1組缺血再灌注SD大鼠，HE染色顯示神經(jīng)細(xì)胞壞死程度明顯減輕，用免疫組化顯示其腦組織HSP70表達(dá)明顯增加。推測IGF－1在腦缺血再灌注損傷中通過增加HSP70蛋白的表達(dá)而起保護(hù)作用。余國偉等［9］的實驗表明在低溫保存液中添加IGF－1可明顯降低心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，促進(jìn)再灌注期心功能的恢復(fù)。IGF－1的心肌保護(hù)機(jī)制可能與HSP90依賴性Akt激活和線粒體轉(zhuǎn)位有關(guān)。Shan等［10］觀察到，HSP60在缺血再灌注的心肌細(xì)胞中的表達(dá)增加，HSP60可能抑制IGF－1的降解，增大其抗凋亡的作用。

本實驗觀察到HSP27和IGF－1在相同誘發(fā)條件下，其表達(dá)具有空間定位一致、時間變化趨勢相似的特點(diǎn)。表明在沙鼠腦缺血再灌注損傷中HSP27與IGF－1發(fā)揮相互協(xié)同腦保護(hù)作用。作用包括兩方面：一則在缺血再灌注時機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)答，從而HSP27表達(dá)增加，利用其分子伴侶功能，幫助IGF－1折疊及移位，防止其聚集，抑制其降解，還可以幫助變性的IGF－1解聚及復(fù)性，從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用；另則在缺血再灌注后IGF－1可上調(diào)HSP27在腦組織中的表達(dá)，機(jī)制可能為p38MAPK是MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要成員，誘導(dǎo)磷酸化HSP27表達(dá)的上游信號通路來促進(jìn)其細(xì)胞保護(hù)作用［11］，又腦缺血后IGF－1表達(dá)增加，可激活MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，因而HSP27磷酸化后被激活，由胞質(zhì)迅速移入細(xì)胞核而發(fā)揮作用。IGF－1能防止腦缺血再灌注中細(xì)胞內(nèi)鈣超載，減輕了對HSP27表達(dá)的抑制。

在腦缺血再灌注損傷中HSP27和IGF－1對腦組織起重要的保護(hù)作用，是否可以利用 HSP27和IGF－1上述作用以及IGF－1促進(jìn)血管和神經(jīng)再生的作用，研制并開發(fā)藥物，將有巨大的臨床價值。

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