鄭東光，周 蕊，李俊州，余紅雨，文才藝

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

放線菌是尋找和發(fā)現(xiàn)天然生物活性物質(zhì)的重要微生物資源.目前世界藥物市場(chǎng)上67%的抗生素由放線菌產(chǎn)生［1］，因此，從土壤中篩選具有較強(qiáng)拮抗作用的放線菌，并通過其發(fā)酵獲取活性代謝產(chǎn)物，是開發(fā)生物農(nóng)藥的重要途徑［2］.目前，將微生物次生代謝物作為生物農(nóng)藥主要活性成分，應(yīng)用于植物病害治理是植物病害生物防治的主要方式之一［3］.在生物農(nóng)藥生產(chǎn)過程中，微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌種的性能，而且取決于培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件，如營(yíng)養(yǎng)要求、培養(yǎng)溫度、對(duì)氧的要求等.因此，設(shè)計(jì)合理的發(fā)酵工藝，使生產(chǎn)菌種處于最佳產(chǎn)物合成的環(huán)境，可取得最好的發(fā)酵效果［4，5］.瘡痂鏈霉菌(Streptomyces scabiei)是引起馬鈴薯瘡痂病的主要病原菌之一.國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)瘡痂鏈霉菌的研究主要集中在致病性分化、毒素及其遺傳多樣性等方面，近年來，國(guó)外已有將其作為生防菌株和生物代謝活性物質(zhì)來源的研究報(bào)道［6］.如YOO 等［7］報(bào)道，S.scabiei subsp.chosunensis M0137產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物能夠用來治療腫瘤和癌癥;HAN［8］等報(bào)道，S.scabiei Strain PK-A41的次生代謝產(chǎn)物對(duì)辣椒疫霉病菌、小麥紋枯病菌等多種病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用.目前，國(guó)內(nèi)尚未見將其作為生防菌株進(jìn)行研究的相關(guān)報(bào)道.瘡痂鏈霉菌許昌 亞種SCY114 (S.scabiei subsp.xuchangensis SCY114)是1株對(duì)小麥全蝕病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)、小麥紋枯病菌(Rhizotonia cerealis)等多種植物病原真菌有較強(qiáng)拮抗作用的生防鏈霉菌，其活性代謝產(chǎn)物為星形孢菌素(Staurosporine)，具有有效防治小麥全蝕病的生防潛力［9］.本研究對(duì)菌株SCY114的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究，為該菌株的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 瘡痂鏈霉菌許昌亞種SCY114和小麥全蝕病菌均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害生物防治研究室分離、保存.

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(G-1)和抑菌活性測(cè)定培養(yǎng)基(PDA)，按文獻(xiàn)［10］的方法制備;種子培養(yǎng)基為黃豆粉20 g，CaCO35 g，葡萄糖20 g，H2O 1000 mL;基礎(chǔ)培養(yǎng)基為黃豆餅粉20 g，可溶性淀粉20 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，H2O 1000 mL，pH 值7.2～7.4.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子液的制備 用接種針將活化的斜面菌種挖塊接種于裝有125 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于28℃，180 r·min-1條件下培養(yǎng)48 h，備用.

1.2.2 單因素試驗(yàn) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為接種量體積分?jǐn)?shù)5%，種齡48 h，溫度28℃，轉(zhuǎn)速180 r·min-1，培養(yǎng)時(shí)間5 d.分別進(jìn)行如下試驗(yàn):(1)用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖等量替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的可溶性淀粉;(2)用玉米粉、牛肉膏、酵母粉、燕麥粉、蛋白胨等量替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的黃豆餅粉;(3)改變可溶性淀粉的質(zhì)量濃度，依次為0，10，20，30，40，50 g·L-1;(4)改變黃豆粉餅的質(zhì)量濃度，依次為0，10，20，30，40、50，60 g·L-1;(5)改變K2HPO4的質(zhì)量濃度，依次為0，0.25，0.5，0.75，10 g·L-1;(6)改變MgSO4·7H2O的質(zhì)量濃度，依次為0，0.25，0.5，0.75，10 g·L-1.

1.2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇培養(yǎng)基中可溶性淀粉、黃豆粉餅、MgSO4·7H2O、K2HPO44個(gè)因素，分別取3個(gè)水平，并以L9(43)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)［11，12］，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1.

表1 培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)因素和水平Table 1 Orthogonality test of medium formula g·L -1

1.2.4 發(fā)酵條件的研究 采用優(yōu)化培養(yǎng)基，在其他培養(yǎng)條件相同時(shí)，分別進(jìn)行如下試驗(yàn):(1)調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH 值，分別為4，5，6，7，8，9和10;(2)發(fā)酵溫度分別為25，28，30和32℃;(3)搖床轉(zhuǎn)速分別為160，180，200，220 r·min-1;(4)培養(yǎng)裝液量分別為每個(gè)250 mL 三角瓶中裝入60，70，80，90和100 mL;(5)培養(yǎng)時(shí)間分別為24，36，48，60和72 h;(6)接種量分別為體積分?jǐn)?shù)2%，4%，6%，8%，10%和12%.(7)培養(yǎng)時(shí)間分別為1，2，3，4，5，6，7，8，9和10 d.發(fā)酵完畢后，收集發(fā)酵液，測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性.

1.2.5 發(fā)酵液活性測(cè)定發(fā)酵液經(jīng)1000 r·min-1離心15 min后過濾，收集各處理的發(fā)酵濾液，以小麥全蝕病菌為靶標(biāo)，利用含毒介質(zhì)法［13］測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性，每個(gè)處理重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.2 培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同碳源對(duì)菌株SCY114發(fā)酵效果的影響

結(jié)果表明，菌株SCY114 在以蔗糖和麥芽糖作為唯一碳源的條件下，發(fā)酵效果較差，而在葡萄糖、可溶性淀粉和乳糖分別作為唯一碳源時(shí)，發(fā)酵效果較好(圖1).抗生素合成能力從大到小依次為淀粉＞葡萄糖＞乳糖＞蔗糖＞麥芽糖.考慮到實(shí)際生產(chǎn)中淀粉成本低廉，并且由于可溶性淀粉為可緩慢利用的碳源，有利于延長(zhǎng)代謝產(chǎn)物的合成，特別有利于延長(zhǎng)抗生素的分泌期，因此選擇其作為菌株發(fā)酵的碳源.

圖1 不同碳源對(duì)抗生素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on antibiotic yield

2.2.2 不同氮源對(duì)菌株SCY114發(fā)酵效果的影響

在供試的6種氮源中，菌株SCY114 能有效利用玉米粉、黃豆餅粉和燕麥粉，其中以黃豆餅粉和燕麥粉的發(fā)酵效果最佳(圖2).考慮到來源和成本問題，本試驗(yàn)選擇黃豆餅粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源.

圖2 不同氮源對(duì)抗生素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on antibiotic yield

2.2.3 不同質(zhì)量濃度可溶性淀粉對(duì)菌株SCY114發(fā)酵效果的影響 從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中可溶性淀粉質(zhì)量濃度為10 g·L-1時(shí)，發(fā)酵效果最好;當(dāng)可溶性淀粉大于10 g·L-1時(shí)，發(fā)酵效果逐漸降低(圖3).說明在不考慮其他因素影響的前提下，過多的碳源不利于菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累.

圖3 不同質(zhì)量濃度可溶性淀粉對(duì)抗生素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different soluble starch contents on antibiotic yield

2.2.4 不同質(zhì)量濃度黃豆餅粉對(duì)菌株SCY114發(fā)酵效果的影響 從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著黃豆餅粉質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵效果逐漸提高，當(dāng)黃豆餅粉的質(zhì)量濃度為50 g·L-1時(shí)，發(fā)酵效果最佳(圖4).

圖4 不同質(zhì)量濃度黃豆餅粉對(duì)抗生素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different soybean meal contents on antibiotic yield

2.2.5 不同質(zhì)量濃度K2HPO4對(duì)菌株SCY114發(fā)酵效果的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著K2HPO4的含量增加，菌株SCY114發(fā)酵效果逐漸增加，當(dāng)K2HPO4的質(zhì)量濃度為0.75 g·L-1時(shí)，發(fā)酵效果最好(圖5).

2.2.6 不同質(zhì)量濃度MgSO4對(duì)菌株SCY114發(fā)酵效果的影響 從圖6可以看出，MgSO4對(duì)菌株SCY114的發(fā)酵效果影響較大，培養(yǎng)基中加入MgSO4能明顯提高抗生素產(chǎn)量，當(dāng)MgSO4的質(zhì)量濃度為0.25～0.5 g·L-1時(shí)，發(fā)酵效果最好.

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果

從表2中可以看出，4種因素對(duì)發(fā)酵效果的影響大小依次為:K2HPO4(D)＞ MgSO4(C)＞黃豆餅粉(A)＞可溶性淀粉(B).根據(jù)計(jì)算結(jié)果，理論優(yōu)化方案為:A1B3C3D3，即正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表中的組合3，黃豆餅粉40 g·L-1、可溶性淀粉20 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.75 g·L-1，K2HPO41.0 g·L-1.

圖5 K2HPO4質(zhì)量濃度對(duì)抗生素產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of different potassium dihydrogen phosphate contents on antibiotic yield

圖6 MgSO4質(zhì)量濃度對(duì)抗生素產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of different magnesium sulfate contents on antibiotic yield

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results

為了驗(yàn)證此配方是否為最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)其進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，并與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的發(fā)酵效果進(jìn)行比較.結(jié)果表明，優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵效果明顯優(yōu)于基本培養(yǎng)基(圖7).

圖7 優(yōu)化培養(yǎng)基與原始培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果的比較Fig.7 Comparison between optimal medium and original medium

2.4 發(fā)酵條件對(duì)菌株SCY114發(fā)酵效果的影響

2.4.1 初始pH 值對(duì)菌株SCY114發(fā)酵效果的影響 在不同初始pH 值的培養(yǎng)基中，菌株SCY114的發(fā)酵效果有明顯差異(圖8).當(dāng)初始pH 值為3.0時(shí)，不利于菌體生長(zhǎng)而影響其次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累.隨著pH 值升高，發(fā)酵效果逐漸增加，當(dāng)pH 值為6.0～7.0 時(shí)，發(fā)酵效果達(dá)到最佳.當(dāng)pH值大于7.0 時(shí)，發(fā)酵效果逐漸下降.因此，適合菌株SCY114 產(chǎn)素的最適初始pH 值為6.0～7.0.

2.4.2 溫度對(duì)菌株SCY114發(fā)酵效果的影響發(fā)酵溫度對(duì)菌株SCY114發(fā)酵效果有明顯的影響，在25～30℃發(fā)酵效果較好，其中，28℃時(shí)發(fā)酵效果最好(圖9).

圖8 初始pH 值對(duì)抗生素產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of initial pH value on antibiotic yield

圖9 溫度對(duì)抗生素產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of temperature on antibiotic yield

2.4.3 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株SCY114發(fā)酵效果的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速對(duì)菌株SCY114發(fā)酵效果有一定的影響，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為200 r·min-1時(shí)發(fā)酵效果最好(圖10).

圖10 轉(zhuǎn)速對(duì)抗生素產(chǎn)量的影響Fig.10 Effect of rotational speed on antibiotic yield

2.4.4 搖瓶裝量對(duì)菌株SCY114發(fā)酵效果的影響

隨著搖瓶裝液量的改變，菌株SCY114的發(fā)酵效果出現(xiàn)明顯變化，其中250 mL 三角瓶裝入70 mL時(shí)發(fā)酵效果最佳，即體積分?jǐn)?shù)為28%的裝液量有利于菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累(圖11).

2.4.5 種齡對(duì)菌株SCY114發(fā)酵效果的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株SCY114 在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48 h后接種，對(duì)發(fā)酵效果影響不大，種齡超過48 h后，發(fā)酵效果逐漸降低(圖12).考慮到種子培養(yǎng)時(shí)菌株生長(zhǎng)的同步性和發(fā)酵成本，以種齡36 h為宜.

圖11 裝液量對(duì)抗生素產(chǎn)量的影響Fig.11 Effect of cultural broth volume on antibiotic yield

圖12 種齡對(duì)抗生素產(chǎn)量的影響Fig.12 Effect of seed age on antibiotic yield

2.4.6 接種量對(duì)菌株SCY114發(fā)酵效果的影響試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)接種量體積分?jǐn)?shù)小于6%時(shí)，發(fā)酵效果逐漸增加;接種量為6%時(shí)，發(fā)酵效果最好;當(dāng)接種量體積分?jǐn)?shù)大于6%時(shí)，發(fā)酵效果逐漸降低(圖13).

圖13 接種量對(duì)抗生素產(chǎn)量的影響Fig.13 Effect of inoculation volume on antibiotic yield

2.4.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株SCY114發(fā)酵效果的影響

在相同的發(fā)酵條件下，菌株SCY114的活性代謝物產(chǎn)量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，在第5 d時(shí)，抗生素產(chǎn)量達(dá)到高峰，此后，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，抗生素產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，與第5天的產(chǎn)量基本維持在同一水平(圖14).由此可見，5 d 是其發(fā)酵最佳時(shí)間，既保證了抗生素的產(chǎn)量，又節(jié)約了成本，同時(shí)也避免了發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致菌絲體自溶而影響代謝活性物質(zhì)的積累.

圖14 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抗生素產(chǎn)量的影響Fig.14 Effect of fermentation time on antibiotic yield

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)生防菌株SCY114發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化，得出菌株SCY114 最佳培養(yǎng)基配方為:可溶性淀粉20 g·L-1、黃豆餅粉40 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.75 g·L-1和K2HPO41.0 g·L-1.最佳搖瓶發(fā)酵條件為:初始pH 值7.0，發(fā)酵溫度28℃，種子液種齡36 h，接種量6%，裝液量70 mL三角瓶(250 mL)，轉(zhuǎn)速200 r·min-1，發(fā)酵時(shí)間5 d.可溶性淀粉和黃豆餅粉作為菌株的主要營(yíng)養(yǎng)成分，達(dá)到了降低成本提高效價(jià)的目的，為進(jìn)一步的試驗(yàn)發(fā)酵奠定了基礎(chǔ).

微生物發(fā)酵生產(chǎn)中，為了提高抗生素的產(chǎn)量，既要提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，滿足微生物菌體生長(zhǎng)、代謝產(chǎn)物積累的需要，也要考慮原料的成本和來源.碳源篩選試驗(yàn)中，葡萄糖和可溶性淀粉對(duì)抗生素產(chǎn)量都有較大的提高，但葡萄糖作為試驗(yàn)室的生化試劑，價(jià)格高，不適于作為工業(yè)化生產(chǎn)的主要碳源，因此，選用可溶性淀粉為最佳碳源，但是，培養(yǎng)基中過量的碳源不利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累，發(fā)酵過程控制時(shí)不必進(jìn)行碳源補(bǔ)給;氮源篩選試驗(yàn)中，用黃豆餅粉和燕麥粉做氮源時(shí)，發(fā)酵效果均較其他氮源好，考慮到黃豆餅粉是發(fā)酵工業(yè)中最常用的有機(jī)氮源，蛋白質(zhì)含量可達(dá)40%左右，并且其中硫氮基酸的含量較高，能促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累［14］，且原料來源豐富，故選用黃豆餅粉為最佳氮源.

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