孔漢金，張克山，劉永杰，尚佑軍，吳 斌，劉湘濤

（1.中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 國家口蹄疫參考實驗室 蘭州730046；2.華中農業(yè)大學 農業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢 430070）

綿羊肺腺瘤（ovine pulmonary adenomatosis,OPA）是由外源性綿羊肺腺瘤反轉錄病毒（exogenous Jaagsiekte sheep retrovirus, exJSRV）引起的成年綿羊慢性、進行性、接觸傳染性肺臟疾病[1]。除了大洋洲外，本病已在全球各地發(fā)生[2]。該病潛伏期長，病羊臨床主要表現為咳嗽，呼吸困難，大量漿液性鼻漏，病理學表現為肺泡和支氣管上皮出現腫瘤性增生等典型特征[3]。JSRV感染綿羊后，在自身編碼的逆轉錄酶作用下形成了前病毒及其兩端的長末端重復序列（LTR）, 并通過整合酶整合到宿主細胞基因組中暫時或長期存在[4]。前病毒DNA編碼區(qū)內有典型反轉錄病毒相互重疊的gag，pol，pro，env基因結構[5]。

幾乎所有真核生物中都存在有與水平傳播的致病性外源性逆轉錄病毒相對應的內源性反轉錄病毒（Endogenous ret-rovirus，ERVs），ERVs是遠古反轉錄病毒感染宿主種系后并可垂直傳播的宿主基因組中的基因片段[6,7]。關于ERVs 的功能目前仍不完全清楚，在正常綿羊和山羊基因組內發(fā)現含有15～20 拷貝的與exJSRV 序列密切相關的內源性綿羊肺腺瘤病毒（endogenous Jaagsiekte sheepretrovirus，enJSRV）, 在每個特定物種的個體中都存在[8]。enJSRV基因組結構包括兩端非編碼區(qū)（5′, 3′LTR）及gag, pol, pro, env等 4 個編碼基因。JSRVenv基因編碼病毒囊膜前體蛋白經水解后產生表面蛋白（SU）和跨膜蛋白（TM）[9]。Exenv與Ⅱ型肺泡上皮細胞Hyal2受體結合，激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，促進細胞內特異性轉錄因子，導致細胞轉化的發(fā)生和病毒大量增殖從而誘發(fā)OPA腫瘤形成[10]。研究表明外源性env基因是JSRV誘導Ⅱ型肺泡上皮細胞轉化的必需基因[11]，但所有內源性env基因不能誘導細胞轉化[12]。Exenv與外源性Enenv有著相同的受體Hyal2，可通過競爭性與受體結合阻止exJSRV感染。而且研究證實Enenv在孕體發(fā)展和胎盤形態(tài)發(fā)生過程中扮演重要生理角色[13,14]。

本文克隆并測定了Enenv序列，進行了Enenv和Exenv核苷酸、推導的氨基酸、基因結構及其蛋白B細胞表位比較分析，為進一步深入探究env功能提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料山東某羊場健康綿羊肺臟。ExTaqDNA 聚合 酶、dNTP、IPTG、X-gal、DNA Marker DL2000,pMD18-T 購自寶生物工程有限公司；Tissue／blood DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司。質粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒購自ENZA公司。

1.2 綿羊基因組DNA的提取取綿羊肺臟樣品約100 mg 置于研缽中，加入液氮研成粉末，參照組織基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN）說明書的要求和步驟，提取總DNA。經紫外分光光度計檢測濃度和純度，-80℃保存。

1.3 引物設計 基因擴增參照GenBank公布的內源性綿羊肺腺瘤病毒env（AF153615）基因序列，應用primer 5.0軟件設計如下引物。上引物:TTCAGCAGCCCAGCGATTT；下引物:AGGG AGCTTAGGTACTTGTCC，均由上海生物工程有限公司合成。以1.2提取的DNA為模板，加入上游引物和下游引物進行PCR反應。反應體系:模板5 uL，premix ExTaq25 uL， 上 下 引 物 各 1 uL，ddH2O 補充至 50 uL。反應條件:94℃預變性 5 min；94℃變性 1 min，55℃退火 45 s，72℃延伸 3 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴增結束后，取反應液5～10 uL，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。參照PCR 產物純化試劑盒（ENZA）說明，將PCR 產物切膠回收純化，與pMD18-T 載體連接，連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布含氨芐青霉素、X-gal和IPTG的選擇平板上培養(yǎng)12～16 h, 然后進行藍白斑篩選，挑取白色單菌落接種含LB的細菌瓶，搖床培養(yǎng)6 h后進行菌液PCR鑒定。擴增條件和反應參數與上述PCR反應相同。

1.4 序列測定和遺傳進化分析將上述PCR鑒定陽性的菌株送上海美吉測序公司測序，應用DNAStar軟件通過Cluster W方法對測得的基因序列和GenBank公布的參考序列分別進行核苷酸和氨基酸水平的同源性分析和構建遺傳進化樹。

1.5 Enenv和Exenv蛋白結構與功能比較分析

1.5.1 Enenv和Exenv蛋白質一級結構分析 以外源性綿羊肺腺瘤病毒美國代表株JSRV21（AF105220）env基因作為Exenv用于本次研究的比較對象，運用在線Expasy工具ProtParam分析Enenv和Exenv所編碼的蛋白分子理化特性。利用DNAStar元件的Kyte_Doolittle方法預測兩者編碼蛋白的親水性和疏水性，利用TMHMM2.0和Expasy中的SOSUI和SignalIP分析工具預測兩者編碼蛋白的跨膜區(qū)以及信號肽。

1.5.2 Enenv和Exenv蛋白質二級結構分析 利用DNAStar 分析軟件對Enenv和Exenv進行蛋白質二級結構預測并作比較分析。利用Emini軟件對氨基酸序列的帶電量, 表面暴露區(qū)進行分析。綜合考慮蛋白質親水性，表面可能性，抗原性指數等參數，確定兩基因編碼蛋白的B細胞抗原優(yōu)勢表位。

1.5.3 Enenv和Exenv蛋白質結構域與功能分析 含有保守氨基酸序列的基序組成結構域，是蛋白質序列功能，結構和進化的單元。利用簡單模塊構架搜索工具（SMART）和Interpro數據庫預測和比較分析Enenv和Exenv所編碼蛋白的結構功能域。

1.5.4 Enenv和Exenv蛋白質三維結構分析 將Enenv和Exenv基因推導的氨基酸序列提交Swiss-Model，使用RasMol分析軟件得到兩者三維結構模型并進行比較分析。

2 結果

2.1 序列測定及系統(tǒng)進化分析PCR擴增得到大小約2000 bp的基因片段，與預期結果一致（圖略），序列測定結果表明Enenv基因大小為1836 bp，編碼611個氨基酸，GC含量為39.22%。將該基因序列提交GeneBank，獲得序列號為（JX843793），命名為enJSRV-SD。從Genbank上獲得外源性env參考序列美國代表株JSRV21，分析發(fā)現Exenv基因全長1848 bp，編碼615個氨基酸，GC含量41.18%。Enenv和Exenv的核苷酸同源性為88.1%，差異主要集中在1200～1795區(qū)段，位于env基因的TM區(qū)，多為單個堿基的改變，且發(fā)現Enenv和Exenv相比在1756～1770區(qū)段缺失了一段序列。Enenv和Exenv推導的氨基酸序列同源性為92.0%，兩者主要差異位于478～599區(qū)段，Exenv氨基酸序列TM區(qū)發(fā)現有YRNM序列，而Enenv在相同位置為XKNM，在其他區(qū)段也未發(fā)現致病exJSRV特有的YXXM基序。

將本次測得的內源性env序列與Genbank公布的其他內源性和外源性env序列進行比較分析。本次測定的Enenv與國內外發(fā)布的enJSRVenv基因推導的氨基酸水平同源性為97.2%～99.2%；與內源性綿羊肺腺瘤病毒南非代表株enJS56A1（AFl53615）的氨基酸同源性最高為99.2%；與exJSRVenv的同源性較低，推導的氨基酸水平同源性為91.5%～92.0%。且與同屬山羊動物鼻腫瘤病毒env基因（AY197548）推導的氨基酸同源性為89.4%（圖1）。通過遺傳進化樹可以發(fā)現本次克隆的Enenv基因與AFl53615參考毒株親源關系最近，處于同一分支（圖2）。

2.2 Enenv和Exenv蛋白結構與功能比較分析

2.2.1 Enenv和Exenv蛋白質一級結構分析 蛋白一級結構分析發(fā)現Enenv和Exenv兩者在蛋白分子量，理論等電點，正負電氨基酸個數，脂肪系數和半衰期以及總平均疏水指數等理化性質上具有相似的特性。但兩者的不穩(wěn)定系數有所不同，根據Protparam定義，不穩(wěn)定系數分值小于40的蛋白穩(wěn)定，表明內源性env蛋白不穩(wěn)定（V:40.68），而Exenv穩(wěn)定（V:36.66）。用Kyte-Doolittle法進行親水性分析發(fā)現Enenv和Exenv具有較強的親水性，由圖3可看出兩者親水區(qū)主要都集中在為1～57、97～108、142～151、169～184、228～243、427～438、453～494、592～612等8個區(qū)段。使用SOSUI元件分析發(fā)現Enenv和Exenv蛋白都含有兩個跨膜區(qū)，且在相同位置處（381～403、548～570）（圖 4）。使用big-PI Predictor元件預測兩蛋白都未發(fā)現GPI位點，使用Signal IP分析表明兩者也都無信號肽。

圖1 enJSRV 和 exJSRV 各代表株間氨基酸同源性分析Fig.1 The identity of enJSRV and exJSRV amino acid sequences of different strains

圖2 enJSRV 和 exJSRV 各代表株間氨基酸水平系統(tǒng)進化樹Fig.2 The Phylogenetic tree for different strains of enJSRV and exJSRV amino acid sequences

2.2.2 Enenv和Exenv蛋白質二級結構分析 Enenv推導的蛋白在第350～369區(qū)段，第505～517區(qū)段和第573～606區(qū)段為α螺旋區(qū)域；β折疊區(qū)域有43個區(qū)段，不規(guī)則地分布于整個Enenv蛋白；有28個轉角區(qū)域和26個無規(guī)則卷曲區(qū)域。Exenv和Enenv二級結構基本相似，不同的是Exenv在第540～560區(qū)段只有1個α螺旋區(qū)域，而Enenv有2個，但enJSRV-SD在第25位置處多出1個α螺旋區(qū)域；Enenv在第520～600區(qū)段的β折疊區(qū)域分布明顯要比Exenv密集，且Exenv在第610處多1個轉角區(qū)域（圖5）。

2.2.3 Enenv和Exenv蛋白質結構域與功能分析 結果表明Enenv和Exenv蛋白結構域極其相似，都含有1個GP41結構域，該結構域在Enenv蛋白中位于第399-608區(qū)段，而在Exenv蛋白中位于399～597。Enenv蛋白都含有2個跨膜結構域，且分布在第381-403、548-570區(qū)段，經SMART分析發(fā)現由于該區(qū)段有其他結構域覆蓋而未顯現出來。Enenv和Exenv蛋白質二級結構的抗原表位分析結果見圖6。綜合α-螺旋和β-折疊結構少、富含β-轉角和無規(guī)則卷曲區(qū)域，選擇抗原性指數（antigenicity）大于0、親水性（hydrophilicity）指數大于0、氨基酸位于蛋白分子表面可能性大于1并且鄰近柔性結構等參數，Enenv蛋白的B細胞表位可能位于30-35、171-175、178-181、228-233、237-243、477-479和608-610氨基酸區(qū)域內或附近。Exenv蛋白的B細胞表位與Enenv蛋白基本相同，可能位于16-20、30-35、178-181、228-233、477-479和 608-610氨基酸區(qū)域內或附近。

2.2.4 Enenv和Exenv蛋白質三維結構分析 將內外源性env基因推導的氨基酸序列提交Swiss-Model, 使用PyMOL顯示工具得到其三維結構模型（圖7）。兩者預測的三維模型結構基本相似，從圖中可明顯看到Exenv蛋白比Enenv蛋白在肽鏈末端多出1個α螺旋。

圖3 Enenv(A)和Exenv(B)蛋白親水性（Kyte-Doolittle法）Fig.3 The hydrophilicity plot of Enenv(A) protein and Exenv(B) protein

圖4 內源性env(A)和外源性env(B)編碼蛋白的跨膜區(qū)Fig.4 The transmembrane domain of Enenv(A) protein and Exenv(B) protein

圖5 內源性env（Ⅰ）和外源性env（Ⅱ）蛋白二級結構預測結果（Gamier-Robson 方法）Fig.5 Secondary structure of Enenv(Ⅰ )and Exenv(Ⅱ )protein predicted by the method of Gamier-Robson

圖6 內源性env(A)和外源性env(B) 蛋白的親水性、抗原指數及其表面可能性分析Fig.6 Analysis of hydrophilicity plot, antigenic index and surface probability of the Enenv(A) protein and Exenv(B) protein

圖7 內源性env（A）和外源性env（B）蛋白三維結構預測圖（帶狀結構）Fig.7 The predicted 3-D structure for env protein of Enenv and Exenv generated by PyMOL（Ribbons model）

3 討論

本研究以山東某羊場健康羊肺臟組織提取的基因組DNA為模板擴增enJSRV的env基因，測序后預測其二三級蛋白結構和抗原表位并與外源性綿羊肺腺瘤病毒美國代表株JSRV21 env作比較分析。序列分析發(fā)現Enenv和Exenv在核苷酸水平和結構基因編碼蛋白的特征上具有一定的差異。對內外源性env基因核苷酸序列比較發(fā)現兩者的突變位置主要發(fā)生在env基因的TM區(qū)，這與文獻報道的exJSRV與enJSRV之間的核苷酸序列變異集中在LTR 的U3 和Env基因的TM區(qū)相一致[9]，且符合反轉錄病毒變異的一般規(guī)律。

遺傳進化樹分析顯示enJSRV-SD與古老型enJS56A1（AF153615）處在同一分支，具有較近的親緣關系，可見至今我國山東綿羊染色體上保留的enJSRV-SD是古老型的，遺傳相對穩(wěn)定。還發(fā)現參與序列比較的內外源性綿羊肺腺瘤病毒分別處于兩個不同的大的進化分支上，這也在一定程度上可以作為區(qū)別內外源性綿羊肺腺瘤鑒定診斷方法之一[5]。在所有的外源性肺腺瘤病毒env蛋白的胞質尾部包含高度保守的YXXM基序，酪氨酸（Y）磷酸化后作為PI3K/p85調節(jié)亞基的結合位點，外源性肺腺瘤病毒可通過env蛋白的胞質尾與其相應受體結合誘導靶細胞信號轉導失調，導致細胞增生癌變。而無轉化特性的內源性綿羊肺腺瘤病毒的env蛋白無此基序[15]。本次研究擴增的Enenv基因推導的氨基酸序列為HKNM支持了這一結論。

目前預測蛋白質疏水性最為廣泛的方法是Kyte-Doolittle法。內外源性env基因編碼的蛋白質二級結構總平均疏水指數（GRAVY ）分別為-0.044和-0.041，表明內外源性env蛋白都為親水性?？缒^(qū)預測發(fā)現內外源性env蛋白都含有兩個跨膜區(qū)，并且分布位置大致相同，env基因編碼前體蛋白經水解后產生TM和SU，而TM實質是env蛋白的跨膜結構域。

對內外源性env蛋白的二級結構預測發(fā)現兩者也極為相似，這說明兩者可能具有某些相似的功能。結構域功能比較分析發(fā)現兩者都含有GP41蛋白結構域，該結構域常常存在于各種逆轉錄病毒的囊膜蛋白上，比如HIV和SIV的囊膜蛋白的GP41亞基，其作用是調控病毒入侵階段的膜融合[16]，其蛋白衍生物可以阻止HIV-1進入人類CD4+細胞和其他細胞系，目前該蛋白已成為研發(fā)抵抗HIV和相似逆轉錄病毒的基因治療研究的熱點[17]。

蛋白質二級結構分析與表位分布有較大關系，螺旋區(qū)段及折疊區(qū)段因其結構規(guī)則，有氫鍵維持結構，不易形變，主要起穩(wěn)定結構作用，而轉角區(qū)域和無規(guī)則卷曲區(qū)域多位于球蛋白分子表面，在此改變多肽鏈方法的阻力較小，故易于形變，有利于與抗體結合，從而成為抗原表位的可能性較大。綜合考慮這幾種因素，預測發(fā)現內外源性env蛋白的B細胞抗原表位分布位置也大致相同。Env蛋白作為exJSRV的囊膜成分，存在潛在的黏多糖結合位點。然而對于JSRV感染，機體缺乏針對病毒蛋白的特異性細胞和體液免疫應答[2]，這可能是由于綿羊在胸腺T淋巴細胞發(fā)育期間表達enJSRV env蛋白能與Hyal2結合從而造成了機體對JSRV的免疫耐受[18]。

內外源性env蛋白具有相似的三維結構表明內外源性env蛋白可能具有相同的受體，事實上兩者都可與受體Hyal2結合啟動機體內細胞不同的信號途徑。enJSRV不僅參與綿羊形成針對exJSRV感染的免疫耐受，而且還與孕體發(fā)展有關。反芻動物的妊娠識別信號胎盤干擾素的分泌與enJSRV env蛋白和Hyal2結合有關，懷孕12 d時，enJSRV env轉錄和表達抑制會造成胚胎植入前發(fā)育期孕體的不正常擴展，由固體形式變成絲狀，從而不能附著子宮壁上[19]。并且Enenv蛋白與其受體Hyal2共表達能通過調節(jié)細胞融合促使巨細胞合胞體斑塊形成，而巨細胞合胞體斑塊又是胎盤形成的關鍵[20,21]。目前env蛋白與Hyal2在空間結構作用的具體機制仍不清楚。Enenv的胞質尾區(qū)沒有酪氨酸殘基序列YXXM以及其他部位的序列差異，這可能導致Enenv三維結構與Exenv有著微小的差異，這種差異使得Enenv蛋白不能結合PI3K和激活Akt下游信號通路，最終導致Enenv蛋白無致瘤活性。本次研究通過對綿羊肺腺瘤內、外源性env基因的比較分析，為內外源性Env蛋白功能研究提供了線索，進而為綿羊肺腺瘤病毒的致病機制研究提供了理論依據。

[1]Griffiths D J, Martineau H M, Cousens C,et al.Pathology and Pathogenesis of Ovine Pulmonary Adenocarcinoma[J].J Comp Pathol 2010, 142(4)： 260-283.

[2]Sharp J M, DeMartini J C.Natural history of JSRV in sheep[J].Curr Top Microbiol, 2003, 275： 55-79.

[3]劉淑英, 馬學恩.綿羊肺腺瘤病研究進展[J].動物醫(yī)學進展, 2003, (1)： 19-22.

[4]Holland M J, Palmarini M, Garcia-Goti M,et al.Jaagsiekte retrovirus is widely distributed both in T and B lymphocytes and in mononuclear phagocytes of sheep with naturally and experimentally acquired pulmonary adenomatosis[J].J Virol, 1999, 73(5)： 4004-4008.

[5]Johnson C, Fan H.Jaagsiekte Sheep Retrovirus and Lung Cancer[J].Cancer Associated Viruses, 2012： 755-791.

[6]Boeke J, Stoye J.Retrotransposons, endogenous retroviruses, and the evolution of retroelements[M].Retroviruses Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1997： 343-435.

[7]Lee Y N, Bieniasz P D.Reconstitution of an infectious human endogenous retrovirus[J].Plos Pathog, 2007, 3(1)：119-130.

[8]周艷喜, 蘇佳, 李靖, 等.內源性綿羊肺腺瘤病毒全基因組序列測定與序列分析[J].中國獸醫(yī)學報, 2012, (7)：962-966.

[9]York D, Vigne R, Verwoerd D,et al.Nucleotide sequence of the jaagsiekte retrovirus, an exogenous and endogenous type D and B retrovirus of sheep and goats[J].J Virol,1992, 66(8)： 4930-4939.

[10]Zavala G, Pretto C, Chow YHJ,et al.Relevance of Akt phosphorylation in cell transformation induced by Jaagsiekte sheep retrovirus[J].Virology, 2003, 312(1)：95-105.

[11]Maeda N, Palmarini M, Murgia C,et al.Direct transformation of rodent fibroblasts by jaagsiekte sheep retrovirus DNA[J].Proc Natl Acad Sci, 2001, 98(8)：4449-4454.

[12]Arnaud F, Caporale M, Varela M,et al.A paradigm for virus-host coevolution： Sequential counter-adaptations between endogenous and exogenous retroviruses[J].Plos Pathog, 2007, 3(11)： 1716-1729.

[13]Palmarini M, Gray C A, Carpenter K,et al.Expression of endogenous betaretroviruses in the ovine uterus：Effects of neonatal age, estrous cycle, pregnancy, and progesterone[J].J Virol, 2001, 75(23)：11319-11327.

[14]Dunlap K A, Palmarini M, Adelson D L,et al.Sheep endogenous betaretroviruses (enJSRVs) and the hyaluronidase 2 (HYAL2) receptor in the ovine uterus and conceptus[J].Biol Reprod, 2005, 73(2)： 271-279.

[15]Liu S L, Miller A D.Oncogenic transformation by the jaagsiekte sheep retrovirus envelope protein[J].Oncogene,2007, 26(6)：789-801.

[16]He Y X, Cheng J W, Li J J,et al.Identification of a critical motif for the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) gp41 core structure： Implications for designing novel anti-HIV fusion inhibitors[J].J Virol, 2008, 82(13)：6349-6358.

[17]Zahn R C, Hermann F G, Kim E Y,et al.Efficient entry inhibition of human and nonhuman primate immunodeficiency virus by cell surface-expressed gp41-derived peptides[J].Gene Ther, 2008, 15(17)： 1210-1222.

[18]Spencer T E, Mura M, Gray C A,et al.Receptor usage and fetal expression of ovine endogenous betaretroviruses：Implications for coevolution of endogenous and exogenous retroviruses[J].J Virol, 2003, 77(1)： 749-753.

[19]Bazer F W, Burghardt R C, Johnson G A,et al.Interferons and progesterone for establishment and maintenance of pregnancy： interactions among novel cell signaling pathways[J].Reprod Biol, 2008, 8(3)： 179-211.

[20]Dunlap K A, Palmarini M, Spencer T E.Ovine endogenous betaretroviruses (enJSRVs) and placental morphogenesis[J].Placenta, 2006, 27： S135-S140.

[21]Dunlap KA, Palmarini M, Varela M,et al.Endogenous retroviruses regulate periimplantation placental growth and differentiation[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2006,103(39)： 14390-14395.