郝貴杰，盛鵬程，林 鋒，潘曉藝，徐 洋，姚嘉赟，尹文林，曹 錚，袁雪梅，藺凌云，沈錦玉

(1．浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江 湖州 313001;2．寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211)

0 引言

草魚是我國淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一，其主要疾病——草魚出血病能夠引起草魚大批死亡，嚴重影響我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，其病原為草魚呼腸孤病毒 (grass carp reovirus，GCRV)．GCRV為呼腸孤病毒科水生呼腸孤病毒屬成員中毒力最強的病毒[1]．該病流行于我國各地養(yǎng)殖區(qū)，死亡率可達50%～80%，每年可造成數(shù)萬噸草魚產(chǎn)量的損失，嚴重影響我國草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展．目前對于該病毒還沒有特效的治療方法，早期快速診斷草魚GCRV是目前草魚養(yǎng)殖的主要預(yù)防措施和減少草魚損失的有效途徑．經(jīng)典的草魚呼腸孤病毒 (GCRV)檢測方法包括用細胞系進行擴增分離、純化病毒檢測、電鏡觀察，但這些方法既費力又耗時．隨著技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了其他的檢測方法，如免疫酶染色法[2]、葡萄球菌協(xié)同凝集反應(yīng)[3]及酶聯(lián)免疫吸附測定法[4]，然而這些方法都有其局限性．

多聚酶鏈式反應(yīng)PCR(polymerase chain reaction)是一種在20世紀90年代開始被廣泛使用的體外核酸擴增技術(shù)，此法操作簡便，可短時間內(nèi)在微量離心管中獲得數(shù)百萬特異DNA序列的拷貝，目前，該技術(shù)己滲透到分子生物學的各個領(lǐng)域．在水生動物病毒病原檢測方面，也有多個報道[5－7]，早在1997年王鐵輝等[8]建立了檢測GCRV的RT－PCR方法，李軍等[9]也用該方法檢測了病毒攻毒后病魚組織中的病毒，但是他們的這個方法只能檢測草魚呼腸孤病毒的一株病毒，即GCRV－861．2004年，Seng等[10]報道了在水生呼腸孤病毒S6基因片段的保守區(qū)設(shè)計了一對兼并引物并建立了RT－PCR方法檢測水生呼腸孤病毒，取得了較好的結(jié)果．本試驗根據(jù)GenBank已發(fā)表的GCRV及其他水生呼腸孤病毒的第六基因片段，在保守區(qū)設(shè)計了一對GCRV特異性引物，以期建立一種快速、簡便、靈敏及廣譜的檢測草魚呼腸孤病毒的RT－PCR的方法，為草魚GCRV的快速診斷、病原調(diào)查及常規(guī)檢測提供技術(shù)支撐．

1 材料與方法

1.1 材料

1)毒株及細胞來源 試驗選用一株已完成全部基因組序列測定的草魚呼腸孤病毒作為標準參考株，草魚腎細胞系[11](CIK)由長江所惠贈．

2)工具酶和試劑 Taq酶、dNTP、反轉(zhuǎn)錄酶 (AMV)、RNase抑制劑均購自大連寶生物工程有限公司，Trizol、DEPC、DMEM培養(yǎng)基為Sigma公司產(chǎn)品，PCR純化試劑盒為愛思進生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，小牛血清購自杭州四季青公司，其他試劑為分析純．引物合成在invitrogen(上海)英駿生物技術(shù)有限公司完成．

1.2 方法

1)細胞培養(yǎng)及病毒傳代 ①細胞傳代:把已長成致密單層的草魚CIK細胞系，用0.25%(質(zhì)量分數(shù))胰蛋白酶和0.02%(質(zhì)量分數(shù))乙二胺四乙酸二鈉混合消化液消化約5 min，然后倒掉消化液，再加入細胞生長液，用吸管吹打分散細胞，最后分裝細胞瓶 (3 cm×6 cm)，使細胞傳代接種量為2.5×105·mL－1，待細胞基本長滿單層時用于病毒接種．②病毒傳代:將病毒培養(yǎng)液反復(fù)凍融3次，凍融液按5%(體積分數(shù))的比例接種于已長成單層的CIK細胞，28℃孵育1 h后倒去病毒液，然后加入維持液 (含2%(體積分數(shù))小牛血清的DMEM培養(yǎng)液)繼續(xù)培養(yǎng)，并設(shè)不接毒的CIK細胞作為陰性對照．24 h后開始觀察細胞病變 (CPE)，CPE出現(xiàn)80%(體積分數(shù))以上時收獲．

2)引物設(shè)計 參照文獻 [10，12]，在GCRV第6基因片段設(shè)計一對特異性引物:P1，5'-ATC-CCGTATATCTATGGCTT－3';P2，5'-TTGGAGACGAACATAGACGC-3'，預(yù)期片段436 bp．

3)組織及細胞感染病毒RNA的提取及RT反應(yīng) 參照文獻 [12－13]的方法進行．

4)PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化 ①引物濃度的優(yōu)化 PCR反應(yīng)體系總體積為50μL:10×PCR Buffer(含Mg2+)5.0 μL，dNTP 4 μL，Taq DNA聚合酶2.5 U，上下游引物終濃度分別為1、40、80、120、160、200 nmol/L，反轉(zhuǎn)錄模板1.0 μL，最后用雙蒸水補足余下體積．反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性4 min，94℃變性50 s，52℃退火50 s，72℃延伸50 s，共進行33個循環(huán)，最后再72℃延伸10 min，12℃保存．以1%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測．②退火溫度的優(yōu)化 PCR反應(yīng)體系同①．反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性4 min;其循環(huán)參數(shù)為94℃變性50 s，分別于56、54、52、50、48℃退火50 s，72℃延伸50 s，共進行33個循環(huán);最后再72℃延伸10 min，12℃保存．PCR產(chǎn)物以1%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測．

5)特異性試驗 分別選取嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)BSK－10、WSSV、正常細胞作為測試對象，應(yīng)用建立的RT－PCR方法進行PCR擴增，以測定其特異性．

6)敏感性試驗 根據(jù)5)中的方法制備細胞培養(yǎng)病毒液的RNA并反轉(zhuǎn)錄，然后將cDNA模板作5倍倍比稀釋，取不同稀釋度的模板DNA各1 μL分別進行PCR擴增．

7)在養(yǎng)殖草魚病害檢測中的應(yīng)用 分別在2007年和2008年在草魚出血病流行季節(jié)，從江西蓮塘魚種養(yǎng)殖地及湖州郊區(qū)采集病魚共5份，按3)的方法提取病魚肝脾腎組織中的病毒RNA，用4)的RT－PCR方法進行檢測，并結(jié)合細胞分離及理化特性鑒定進行驗證．

8)病毒分離 參照文獻 [14]的方法進行，用CIK細胞系進行病毒培養(yǎng)與分離．

9)病毒的鑒定 將細胞分離培養(yǎng)的病毒進行差速及超速離心、純化，負染后進行電鏡觀察、拍照．參照文獻[13]的方法進行測定，分別取一定量的病毒培養(yǎng)液，按一定比例加入乙醚或氯仿，經(jīng)過處理后，測定處理組和對照組病毒液的組織細胞半數(shù)感染量 (TCID50)．

2 結(jié)果

2.1 RNA提取

采用分光光度計測定所提取樣品的總RNA OD260/OD280的比值，均在1.8～2.0之間，這表明，所提取的總RNA中無蛋白質(zhì)和氛類物質(zhì)的干擾，其純度較高，可以達到檢測要求的純度．

2.2 RT－PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.2.1 引物濃度的優(yōu)化

按6種不同引物濃度，采用GCRV參考標準株核酸的反轉(zhuǎn)錄模板進行PCR擴增，結(jié)果如圖1所示．上下游引物濃度分別為120 nmol/L和120 nmol/L時擴增效果最佳．

2.2.2 退火溫度的優(yōu)化

根據(jù)所設(shè)計引物的特點，設(shè)計了5個退火溫度，其電泳結(jié)果如圖2所示，可以看出，退火溫度在50℃、52℃和54℃時，目的基因得到有效擴增，由于52℃時，擴增條帶最為清晰，因此選52℃為優(yōu)化后的退火溫度．

2.3 RT－PCR的特異性

提取本實驗室保存的嗜水氣單胞菌BSK－10、WSSV的核酸、GCRV標準參考株及正常CIK細胞的RNA并進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，分別作為PCR擴增的模板，以測定PCR引物的特異性．PCR體系和條件參照方法4)的優(yōu)化結(jié)果．擴增結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明該對引物特異性很好．

2.4 RT－PCR的敏感性

將GCRV的反轉(zhuǎn)錄模板作5倍倍比稀釋，當稀釋至5－7時，PCR結(jié)果還為陽性，結(jié)果見圖4．

圖1 不同引物濃度的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR results using different primers concentration

圖2 不同退火溫度的PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR results under different annealing

圖3 特異性試驗結(jié)果Fig.3 PCR specificity test

圖4 敏感性試驗結(jié)果Fig.4 PCR sensitivity test

圖5RT-PCR檢測結(jié)果Fig.5 The results of RT-PCR detection

2.5 疑似GCRV感染草魚病樣的檢測

用本RT－PCR方法對江西蓮塘魚種養(yǎng)殖地及湖州郊區(qū)采集的1份病魚樣 (肝、脾、腎)的研磨勻漿進行檢測，結(jié)果 (見圖5)有3份樣品 (分別為JX2007、JX2008和HZ2008)在436 bp處有1條帶，顯示GCRV結(jié)果為陽性;2份為陰性 (分別為HZ07和HZ08)．

2.6 病毒分離培養(yǎng)結(jié)果

將采集到的疑似GCRV感染草魚的5份病樣，接種CIK細胞，RT－PCR檢測結(jié)果 (見圖6)為陽性的樣品均在病毒感染單層細胞后24～36 h，細胞開始出現(xiàn)病變，病變形態(tài)和文獻[14]的描述一致．

2.7 細胞培養(yǎng)病毒的RT－PCR檢測結(jié)果

將CIK細胞分離為陽性的病毒樣品，按照方法3)提取培養(yǎng)細胞總RNA，用所建立的RT－PCR方法進行檢測，結(jié)果如圖7所示．

2.8 病毒鑒定結(jié)果

在電子顯微鏡下觀察到，提純的病毒顆粒大小均一、近似球形、二十面體，直徑約75 nm(見圖8)，是呼腸孤病毒的特征．

圖6 病毒感染細胞病變結(jié)果Fig.6 The CPE result of CIK cells infected by virus

圖7 細胞培養(yǎng)病毒RT-PCR檢測結(jié)果Fig.7 RT-PCR detection of virus in CIK cells

圖8 提純的病毒顆粒 （120 000×）Fig.8 The purified virus particles

3株分離株對氯仿、乙醚的敏感性試驗結(jié)果見表1．結(jié)果表明:氯仿、乙醚處理組病毒的平均組織細胞半數(shù)感染量 (TCID50)變化不大，即病毒的感染力和對照組相比并沒有多大變化，說明所分離的病毒對氯仿和乙醚有一定的抗性．

表1 氯仿、乙醚對3株分離株的影響Tab．1 Effects of chloroform and ether on three virus isolates

3 討論

本研究參考了文獻 [12]，并參考Genbank中的GCRV序列，在其S6基因片段保守區(qū)設(shè)計了一對特異性擴增GCRV的引物，建立了RT－PCR技術(shù)．用RT－PCR檢測RNA的過程中，不但RNA的抽提方法對結(jié)果有影響，所選擇的退火溫度、引物濃度等對其結(jié)果也均有影響．通過優(yōu)化PCR體系，得出最適的上下游引物濃度分別為120 nmol/L和120 nmol/L，最佳的退火溫度為52℃．特異性實驗表明，分別用所提取本實驗室保存的嗜水氣單胞菌BSK－10、WSSV的核酸、GCRV標準參考株及正常CIK細胞的RNA進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，作為PCR擴增的模板，結(jié)果只有GCRV陽性有特異條帶，其他全無特異性條帶，這說明所設(shè)計的該對引物特異性很好．敏感性實驗表明，將GCRV的反轉(zhuǎn)錄模板作5倍倍比稀釋，當稀釋至5－7時 (dsRNA為9×10－8μg時)，PCR結(jié)果還為陽性，說明敏感性較好．針對草魚出血病進行病原檢測，最快可以在8 h內(nèi)完成實驗，從發(fā)病草魚樣品中確診GCRV病原．利用所建立的RT－PCR方法共檢測了5份疑似樣品，結(jié)果有3份為陽性，2份為陰性．為了進一步驗證該方法的準確性，本試驗采用CIK細胞分離的方法對所采5份病樣進行了病毒分離，其中RT－PCR鑒定為陽性的病樣濾液在感染單層細胞后24 h，細胞開始出現(xiàn)病變，病變過程和標準參考株病變一致[14]．進一步提取感染病毒細胞液的RNA進行RT－PCR，也全部為陽性．從純化病毒的電鏡觀察及理化特性分析結(jié)果可以看出，氯仿、乙醚處理組病毒的感染力和對照組相比變化不大，說明所分離的3株病毒對氯仿和乙醚有一定的抗性．這種理化特性可作為此病毒不存在囊膜的證據(jù)，該結(jié)果與柯麗華等[15]報道的一致．

綜上所述，本試驗建立了一種快速、簡便、靈敏的檢測草魚呼腸孤病毒的RT－PCR的方法．體內(nèi)外研究都表明，該方法與傳統(tǒng)的方法相比，具有靈敏性和特異性好并且耗時少的特點，而且和以往的草魚呼腸孤病毒的RT－PCR方法比較，具有較好的光譜性．因此，該方法的建立為草魚呼腸孤病毒的快速診斷、病原調(diào)查及常規(guī)檢測提供了技術(shù)支撐．

[1]RANGEL A A，ROCKEMANN D D，HETRICK F M，et al．Identification of grass carp haemorrhage virus as a new enogroup of aquareovirus [J]．J Gen Virol，1999，80:2399-2402．

[2]葉雪平，楊廣智，羅毅志．免疫酶染色檢測草魚出血病病毒抗原的方法研究[J]．魚病簡訊，1989(2):16-18．

[3]楊廣智，羅毅志，葉雪平．葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗快速檢測草魚出血病病毒 [J]．水產(chǎn)學報，1991，15(1):27-33．

[4]吳禮龍，康惠．草魚出血病的快速ELISA診斷試驗[J]．內(nèi)陸水產(chǎn)，1997(4):2-4．

[5]高隆英，史秀杰，劉葒，等．用RT-PCR法快速檢測鯉春病毒血癥病毒基因[J]．水生生物學報，2002，26(5):452-456．

[6]GUO Z X，WENG S P，LI G，et al．Development of an RT-PCR detection method for mud crab reovirus[J]．Journal of Virological Methods，2008，151:237-241．

[7]陳信忠，蘇亞玲，龔艷清，等．逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng) (RT-PCR)檢測5種養(yǎng)殖石斑魚的神經(jīng)壞死病毒 [J]．中國水產(chǎn)科學，2004，11(3):203－207．

[8]王鐵輝，李軍，易詠蘭，等．用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)檢測草魚出血病病毒的研究 [J]．海洋與湖沼，1997，28(1):1-6．

[9]李軍，王鐵輝，周立冉，等．應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)直接檢測草魚出血病病魚組織的研究 [J]．水產(chǎn)學報，1997，21(2):175-179．

[10]SENG E K，F(xiàn)ANG Q，LAM T J，et al．Development of a rapid，sensitive and specific diagnostic assay for fish aquareovirus based on RT-PCR [J]．Journal of Virological Methods，2004，118:111-122．

[11]左文功，錢華鑫，許映方，等．草魚腎臟組織細胞系CIK的建立[J]．淡水漁業(yè)，1984，14(2):38-39．

[12]徐洋，郝貴杰，沈錦玉，等．兩株草魚呼腸孤病毒江西株的分離與鑒定 [J]．淡水漁業(yè)，2010，40(3):44-49．

[13]郝貴杰，沈錦玉，潘曉藝，等．草魚呼腸孤病毒湖州分離株的分離及鑒定[J]．漁業(yè)科學進展，2011，32(1):47-52．

[14]鄒桂平，方勤．草魚呼腸孤病毒在CIK細胞中復(fù)制及形態(tài)發(fā)生的研究 [J]．中國病毒學，2000，15(2):186-192．

[15]柯麗華，方勤，蔡宜權(quán)．一株新的草魚出血病病毒分離物的特性 [J]．水生生物學報，1990，14(2):153-159．