王俊娟，郭麗雪，陸許可，陰祖軍，王德龍，陳修貴，王帥，樊偉麗，陳超，葉武威

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部棉花生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，河南安陽455000）

脫水素是高度親水性蛋白，在成熟的種子中或在受逆境脅迫的營養(yǎng)組織中大量積累[1]。大量試驗證明脫水素基因表達受干旱、低溫、高鹽等逆境誘導(dǎo)[2-3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，陸地棉脫水素基因GhDHN1全長726 bp，含有1個90 bp的內(nèi)含子，響應(yīng)低溫脅迫，在細胞膜附近起作用[4]；其啟動子含有多個響應(yīng)非生物逆境脅迫的順式作用元件[5]。

內(nèi)含子是真核生物基因組中的獨特成分，在基因演變過程中起著重要的作用[6]?；虻膬?nèi)含子在調(diào)控基因表達方面的研究也越來越受到科研人員的重視[7]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，對陸地棉脫水素基因GhDHN1的結(jié)構(gòu)和內(nèi)含子進行生物信息學(xué)分析，旨在揭示棉花脫水素基因響應(yīng)非生物脅迫的機制。

1 材料與方法

1.1 供試數(shù)據(jù)庫

陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫（http://cgp.genomics.org.cn/page/species/index.jsp）[8]和 NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.2 方法

1.2.1脫水素基因GhDHN1內(nèi)含子序列的獲得。在NCBI數(shù)據(jù)庫下載最新的BLAST程序包，將BLAST本地化[9]，同時將所需數(shù)據(jù)本地化，利用王俊娟等[4]報道的GhDHN1基因組DNA序列和內(nèi)含子位置，調(diào)取其內(nèi)含子序列。

1.2.2GhDHN1基因及其內(nèi)含子中AT含量計算。利用DNANMAN 6.0軟件計算GhDHN1基因和內(nèi)含子中各堿基的含量。

1.2.3GhDHN1的內(nèi)含子中順式作用元件分析。利用植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫P1antCARE在線啟動子 預(yù) 測 工 具 （http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測GhDHN1內(nèi)含子中的順式調(diào)控元件。

1.2.4脫水素基因GhDHN1及內(nèi)含子CpG島分析。利用在線分析 CpG island finder（http://dbcat.cgm.ntu.edu.tw/）對脫水素基因GhDHN1的基因組DNA序列及其內(nèi)含子序列進行CpG島分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫水素基因GhDHN1結(jié)構(gòu)及其內(nèi)含子序列的獲得

利用本地BLAST調(diào)取GhDHN1基因的內(nèi)含子為：GTAAGTACACTAATTCACCTGTCGTTAAATTAATGGGACTTGGTTGTACTATAATTATC-CTAACATGAAATCTGTTGCCTGAACGTGCAG。GhDHN1內(nèi)含子具有GT-AG規(guī)則的保守序列，即內(nèi)含子5′堿基是GT，3′堿基是AG，推測GhDHN1基因內(nèi)含子具有保守的剪接機制。

前期試驗表明，在該因cDNA的259～348 bp位置上含有1個內(nèi)含子，其外顯子分別位于基因組DNA 的 1～258 bp、349～726 bp[4]；GhDHN1 蛋白的S-片段（包含8個絲氨酸殘基）則位于N端的81～88氨基酸殘基之間[10]，編碼S-片段的核苷酸殘基分別位于內(nèi)含子兩側(cè)，具體對應(yīng)于基因組DNA的位置分別是：編碼第1～5個絲氨酸殘基的核苷酸殘基位于243～257 bp，編碼第6個絲氨酸殘基的核苷酸殘基位于258 bp和349～350 bp，編碼第7～8個絲氨酸殘基的核苷酸殘基位于351～356 bp。

2.2 脫水素基因GhDHN1及其內(nèi)含子AT含量

利用DNANMAN 6.0軟件分析發(fā)現(xiàn)，GhDHN1基因組DNA序列中AT堿基含量為52.62%，GC堿基含量為47.38%；GhDHN1基因的內(nèi)含子序列中AT堿基含量為63.33%，GC堿基含量為36.67%；GhDHN1基因的2個外顯子中AT堿基含量分別為48.45%和52.91%。

2.3 脫水素基因GhDHN1內(nèi)含子順式作用元件分析

利用在線軟件P1antCARE預(yù)測脫水素基因內(nèi)含子中的順式作用元件，結(jié)果顯示，GhDHN1基因的內(nèi)含子中含有6個順式作用元件（表1），其中正鏈中含有2個順式作用元件，分別是光響應(yīng)的保守DNA模塊的部分元件和赤霉素響應(yīng)元件，說明該內(nèi)含子可能參與了該基因的轉(zhuǎn)錄或調(diào)控活動。

2.4 脫水素基因GhDHN1及其內(nèi)含子的CpG島分析

CpG島分析表明，GhDHN1基因的cDNA及內(nèi)含子的序列上均沒有CpG島，這與其AT含量高的結(jié)果相一致。

表1 GhDHN1基因內(nèi)含子中的順式作用元件

3 討論與結(jié)論

孫乃恩等[11]研究染色體中富含AT的區(qū)段對于基因的轉(zhuǎn)錄表達具有重要的調(diào)節(jié)功能。本研究中，脫水素基因GhDHN1的內(nèi)含子中AT含量（63.33%）明顯高于2個外顯子中AT的含量（分別為48.45%和52.91%），且存在1個TATA啟動子框的結(jié)構(gòu)，與黃瓜CSHSP70基因的內(nèi)含子中AT含量相似[12]，推測脫水素基因的內(nèi)含子可能具有增強該基因轉(zhuǎn)錄的作用。

Jiménez-Bremont等[13]系統(tǒng)比較了不同植物脫水素基因內(nèi)含子特性，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)SKn型脫水素均含有1個內(nèi)含子，并且此內(nèi)含子與編碼S片段的核苷酸序列有關(guān)，這與本研究結(jié)果相符合。本研究表明，陸地棉GhDHN 1屬于SKn型，其S片段的編碼序列也分別位于內(nèi)含子的兩側(cè)，說明棉花脫水素基因的內(nèi)含子在進化中是相對保守的。

Salgueiro等[14]在基因的內(nèi)含子中也曾發(fā)現(xiàn)啟動子結(jié)構(gòu)，對基因的表達起調(diào)控作用。本研究結(jié)果表明，陸地棉GhDHN1中的1個內(nèi)含子也存在調(diào)控基因表達的重要結(jié)構(gòu)，推測與該基因的功能有關(guān)。陸地棉脫水素基因內(nèi)含子含有多個順式作用元件，其中含有參與光響應(yīng)的部分元件、赤霉素響應(yīng)元件，這與沙冬青脫水素基因AmCIP的內(nèi)含子所含順式作用元件部分相似[15]，說明該區(qū)域響應(yīng)激素、光的刺激，可能在增強基因的抗逆性中起到重要調(diào)控作用，是對啟動子功能的補充。

[1] Xiao Huogen,Nassuth A.Stress-and development-induced expression of spliced and unspliced transcripts from two highly similar dehydrin 1 genes inV.ripariaandV.vinifera[J].Plant Cell Reports,2006,25(9):968-977.

[2] Wahid A,Close T J.Expression of dehydrins under heat stress and their relationship with water relations of sugarcane leaves[J].Biologia Plantarum,2007,51(1):（王俊娟，等）陸地棉GhDHN1基因結(jié)構(gòu)及內(nèi)含子生物信息學(xué)分析104-109.

[3] Shinozaki K,Yamaguchi-Shinozaki K,Shinozaki K,et al.Gene networks involved in drought stress response and tolerance[J].Journal of Experimental Botany,2007,58(2):221-227.

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[5] 王俊娟，王德龍，王帥，等.陸地棉脫水素基因GhDHN1啟動子序列分析[J].中國棉花，2017，44(5)：10-12.

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[13] Jiménez-Bremont J F,Maruri-López I,Ochoa-Alfaro A E,et al.LEA,gene introns:is the intron of dehydrin genes a characteristic of the serine-segment?[J].Plant Molecular Biology Reporter,2013,31(1):128-140.

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[15] 雷晨，劉勝利，于婷喬，等.沙冬青AmCIP基因結(jié)構(gòu)及其內(nèi)含子生物信息學(xué)分析[J].生物技術(shù)通報，2016，32(9)：93-99.