邢亞非* 張 健 黃 波 沈莉莉

（南京白敬宇制藥有限責任公司，江蘇 南京 210038）

含潔爾滅類消毒劑微生物限度檢查方法的探討

邢亞非* 張 健 黃 波 沈莉莉

（南京白敬宇制藥有限責任公司，江蘇 南京 210038）

目的 建立含潔爾滅類消毒劑微生物限度檢查方法并對方法進行驗證。方法 薄膜過濾法，采用2%硫代硫酸鈉的1%氯化鈣溶液作中和劑0.1%蛋白胨水溶液作為沖洗劑，消除潔爾滅的殺菌性。結(jié)果與結(jié)論 本方法能有效的檢出檢品的微生物狀況。

潔爾滅類消毒劑；中和劑；回收率

含潔爾滅類消毒劑為陽離子表面活性劑，其特點是易于水，無色，無刺激性，無腐蝕性，性能穩(wěn)定，使用方便，廣泛使用于醫(yī)療衛(wèi)生各區(qū)域[1]。能改變細菌胞質(zhì)膜通透性，使細胞喪失攝取營養(yǎng)物質(zhì)的能力，并抑制菌體的代謝及許多酶系統(tǒng)的活力[2,3]，對革蘭陽性細菌作用較強[2,3]，對綠膿桿菌、抗酸桿菌和細菌芽孢無效[1]。能與蛋白質(zhì)迅速結(jié)合，遇有血、棉花、纖維素和有機物存在，作用顯著降低[3]。主要用于手術前皮膚消毒、黏膜和傷口消毒，手術器械消毒[4]。使用中的消毒劑細菌超標量最早的是新潔爾滅[5,6]，因而有必要對含潔爾滅類消毒劑進行微生物檢查。因本公司處方中含有EDTA、碳酸氫鈉類，故在擬定方法中我們加入了美國藥典附錄61[7]中推薦的中和劑”硫代硫酸鈉及氯化鈣”以消除該產(chǎn)品的抑菌性，參照中國藥典附錄[6]及USP34附錄[7]中外用制劑微生物限度標準，該消毒劑微生物限度標準細菌總數(shù)不得過100cfu/mL（TAMC）、霉菌酵母菌總數(shù)不得過10cfu/mL（TYMC）、金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌不得檢出。

1 試驗材料

1.1 菌種

金黃色葡萄球菌【MCC（B）26003】，大腸埃希菌【CMCC（B）44102】，銅綠假單胞菌【CMCC（B）10104】，枯草芽孢桿菌【CMCC（B）63501】，白色念珠菌【CMCC（F）98001】，黑曲霉菌【CMCC（F）98003】。以上菌種均來自江蘇省食品藥品檢驗所的第三代傳代菌。

1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基，上述培養(yǎng)基均來為北京三藥科技開發(fā)公司產(chǎn)品。沖洗劑：0.1%蛋白胨水溶液、0.9%氯化鈉、稀釋劑：2%硫代硫酸鈉的1%氯化鈣溶液（取20g硫代硫酸鈉10g氯化鈣混合加水溶解加水至1000mL），聚山梨酯80（上海申宇醫(yī)藥化工有限公司）、1%亞碲酸鉀溶液（青島高科園海博生物技術有限公司）。

1.3 藥品

百多邦創(chuàng)面消毒噴霧劑 120401。

2 方法和結(jié)果

2.1 菌液的制備

2.1.1 取大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培物一鉑金餌，加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)增菌液中置30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10-5～10-7使每mL菌液中含50～100CFU的備用。

2.1.2 取白色念珠菌的改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加入改良馬丁增菌液中置20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10-5～10-7使每mL菌液中含50～100CFU的備用。

2.1.3 取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種子改良馬丁瓊脂斜面上，20～25℃培養(yǎng)5～7d，加入3～5mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10-5～10-7使每mL菌液中含50～100CFU的備用。

2.2 培養(yǎng)基適用性檢查

2.2.1 計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基分別按中國藥典2010片附錄ⅩⅠ J微生物限度檢查法計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查要求，被檢培養(yǎng)基上的平均菌落數(shù)大于過去使用經(jīng)過試驗并獲批準的培養(yǎng)基上的平均菌落數(shù)的70%，且菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基上的菌落一致，故該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。

2.2.2 控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查

亞碲酸鉀肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基分別按中國藥典2010片附錄ⅩⅠ J微生物限度檢查法控制菌培養(yǎng)基適用性檢查要求，結(jié)果顯示促生長能力檢查和抑制能力檢查均符合要求。

2.3 驗證方法

2.3.1 計數(shù)菌檢查驗證

①試驗組：取本品10mL加2%硫代硫酸鈉的1%氯化鈣溶液至100mL，分別加入1mL的含50～100CFU/mL的5種試驗菌，作為試驗組。②菌液組：取約10mL的0.1%蛋白胨水溶液潤濕濾膜，分別加入1mL的含50～100CFU/mL的5種試驗菌，作為菌液組。③供試品對照組：取本品10mL加2%硫代硫酸鈉的1%氯化鈣溶液至100mL，作為供試品對照組。④稀釋劑對照組：取2%硫代硫酸鈉的1%氯化鈣溶液至100mL，分別加入1mL的含50～100CFU/mL的5種試驗菌，作為稀釋劑對照組。⑤試驗組的菌數(shù)回收率：試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率。⑥稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率：稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率。⑦薄膜過過濾法：2000mL0.1%蛋白胨水溶液作為沖洗劑沖洗濾膜。⑧回收率結(jié)果均應＞70%且RSD＜15%統(tǒng)計。見表1。

表1 回收率結(jié)果RSD統(tǒng)計表

2.3.2 控制菌方法驗證

①供試液組：取本品10mL加2%硫代硫酸鈉的1%氯化鈣溶液至100mL，過濾，用3000mL的0.1%蛋白胨水溶液沖洗后加入50～100CFU/mL的2種試驗菌，取出濾膜接入相應培養(yǎng)基中置規(guī)定溫度培養(yǎng)。②陽性對照組：取10mL的0.1%蛋白胨水溶液潤濕濾膜，用3000mL的0.1%蛋白胨水溶液沖洗后加入50～100CFU/mL的2種試驗菌，取出濾膜接入相應培養(yǎng)基中置規(guī)定溫度培養(yǎng)。③陰性對照組：取本品10mL加2%硫代硫酸鈉的1%氯化鈣溶液至100mL，過濾用3000mL的0.1%蛋白胨水溶液沖洗后，取出濾膜接入相應培養(yǎng)基中置規(guī)定溫度培養(yǎng)。④薄膜過過濾法：3000mL0.1%蛋白胨水溶液作為沖洗劑沖洗濾膜。⑤結(jié)果：供試液組和陽性對照組均檢出相應的控制菌，陰性對照組無菌生長。

3 討 論

從本次實驗結(jié)果看出，選用2%硫代硫酸鈉的1%氯化鈣溶液作為中和劑0.1%蛋白胨水溶液作為沖洗劑聯(lián)合使用是可以消除潔爾滅類消毒劑的殺菌性的，但沖洗劑用量比較大，因本品是消字號故只是限度標準參照中藥典和美國藥典要求，但沖洗劑用量未完全按中國藥典要求控制。

[1] 張瑋,朱玉玲,孫燕曉,等.復方新潔爾滅消毒劑殺菌效果及毒性試驗觀察[J].醫(yī)學動物防治,2004,20(12):720.

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[3] 雒曉芳,董開忠,王冬梅,等.新潔爾滅對三種細菌效果的抑菌效果研究[J].西北民族大學學報(自然科學報),2009,30(73):64-66.

[4] 曹恒瑜,于佰鳳.苯扎氯銨溶液抗菌能力實驗[J].牡丹江醫(yī)學院學報,2007,28(6):

[5] 林樹培,谷子博.幾種常用消毒劑效果的比較[J].齊齊哈爾醫(yī)學院學報,1995,16(4):306-307.

[6] 中國藥典2010版附錄ⅩⅠ J 微生物限度檢查法[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[7] 美國藥典32版附錄＜61＞ MICROBIAL LIMIT TESTS.2010.

R472.1

B

1671-8194（2013）27-0053-02

*通訊作者