陳友枝，王璐，彭林，丁重陽，張梁，顧正華，石貴陽，章克昌

1 江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122

2 江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫 214122

3 無錫中糧工程科技有限公司，江蘇無錫 214035

漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)又名對聯(lián)苯酚氧化酶，是一種含銅的多酚氧化酶。漆酶具有能夠催化木質(zhì)素的降解、去除芳胺類有毒化合物的毒性、促進真菌色素的合成等作用，在食品工業(yè)、生物檢測、環(huán)境保護、造紙等領域有廣泛的應用潛力[1]。諸多微生物可合成漆酶，最常見的是真菌漆酶，尤其是白腐真菌中側(cè)耳屬漆酶的研究較為廣泛。例如平菇、鳳尾菇、佛羅里達側(cè)耳、杏鮑菇和秀珍菇等[2-3]。阿魏蘑又名阿魏側(cè)耳、阿魏菇，屬擔子菌亞門層菌綱傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬，主要分布于中國新疆的準格爾盆地。目前，對于阿魏蘑的研究極少，且主要集中于多糖的研究[4]，利用阿魏蘑產(chǎn)漆酶的研究還未見報道。在之前的研究中，作者已對阿魏蘑漆酶的發(fā)酵條件和酶學性質(zhì)進行了初步探討，本文主要研究阿魏蘑在發(fā)酵過程中，菌體形態(tài)與漆酶合成之間的關系，以期通過控制菌體形態(tài)進一步提高漆酶產(chǎn)量，加深對絲狀真菌發(fā)酵的認識。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

菌種阿魏蘑Pleurotus ferulae JM30X 來自于新疆準格爾盆地，保存于實驗室。

斜面培養(yǎng)基：PDA 斜面培養(yǎng)基，4℃保存。種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，玉米粉10 g/L，麩皮粉10 g/L，pH 自然。基本培養(yǎng)基：麩皮浸出汁代替麩皮粉，其他成分同種子培養(yǎng)基。其中麩皮浸出汁是將麩皮粉加入1 L 水中，加熱沸水3 h 過濾后獲得。121℃滅菌20 min。

1.2 分析方法

漆酶酶活測定：參考文獻[5]中的方法。

形態(tài)分析：按照文獻[6]中的方法。將菌球面積換算成當量直徑(D)，菌球按D 分為4組。

1.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：取4塊0.5 cm2大小的菌種，接種于80 mL 種子培養(yǎng)基中，120 r/min、25℃培養(yǎng)7 d。發(fā)酵培養(yǎng)：向150 mL 基本培養(yǎng)基中加入5%的種子培養(yǎng)基，120 r/min、25℃培養(yǎng)7 d。

2 結(jié)果與討論

2.1 玻璃珠對菌球形態(tài)和酶活的影響

向基礎培養(yǎng)基中加入5、10、20顆玻璃珠，以不加玻璃珠的培養(yǎng)基為對照，觀察7 d 后菌體形態(tài)(圖1)和各組酶活，A、B、C 和D 組的酶活分別為：1062.0、723.6、477.5和399.7 U/L。結(jié)果顯示，對照組中，菌體形態(tài)為正常的球狀，當增加玻璃珠的個數(shù)時，絮狀菌體的比例不斷增加。在加入20顆玻璃珠時，培養(yǎng)基中的菌體已完全呈絮狀。由此可見，加入玻璃珠帶來的外力對菌體形態(tài)有著重要的影響。而菌體形態(tài)的變化與酶活有一定關系，阿魏蘑的球狀菌體形態(tài)更適于漆酶的合成。絮狀菌體的增加提高了發(fā)酵液的黏度，降低了物質(zhì)、氧氣在發(fā)酵液中的傳遞效率。在一定程度上導致酶活的下降，但是過大的菌球同樣會使內(nèi)部傳質(zhì)、傳氧發(fā)生困難，從而影響產(chǎn)物積累[7-8]，因此需要將菌球控制在一定范圍內(nèi)。

圖1 玻璃珠對菌球形態(tài)的影響(A：不添加玻璃珠；B：5顆玻璃珠；C：10顆玻璃珠；D：20顆玻璃珠)Fig.1 Effect of glass beads on morphology of P.ferulae.(A) No glass bead.(B)5 glass beads.(C)10 glass beads.(D)20 glass beads.

2.2 營養(yǎng)因子對菌球形態(tài)和酶活的影響

2.2.1 葡萄糖濃度對菌球形態(tài)和產(chǎn)漆酶的影響

在基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的葡萄糖，隨著葡萄糖濃度的增加，發(fā)酵液中漆酶酶活隨之增加，同時直徑分布在0.2～0.4 mm 的菌球也有相同的變化趨勢(圖2A)。在葡萄糖濃度為40 g/L 時，漆酶酶活達到最高值2424.4 U/L，直徑分布在0.2～0.4 mm的菌球比例也相應達到最高的33%；當葡萄糖濃度為10 g/L 時，酶活僅為811.8 U/L，而直徑為0.2～0.4 mm 的菌球比例也維持在較低水平。推斷直徑分布在0.2～0.4 mm 范圍的菌球?qū)ζ崦傅暮铣捎兄匾绊憽?/p>

與本研究結(jié)果相似，Papagianni 等報道葡萄糖濃度對黑曲霉的形態(tài)和產(chǎn)檸檬酸量有一定影響，降低初始葡萄糖濃度會導致檸檬酸產(chǎn)量下降，初始葡萄糖濃度不同，菌球的大小也不相同[9]。初始葡萄糖濃度會影響菌絲形態(tài)和產(chǎn)物合成，這種影響可能是通過影響菌絲的生長速度起作用的。在本研究中，較低的初始葡萄糖濃度會降低菌絲生長速率，菌體間相互作用力小，造成了0.2～0.4 mm 直徑的菌球比例降低，使漆酶合成能力降低，這與之前報道的相關絲狀真菌的培養(yǎng)類似，即低濃度的葡萄糖易形成團塊較大的菌體；而當葡萄糖濃度適當提高時，利于M 型(直徑為0.8～2.5 mm)菌球的形成[6,9]。但過高的葡萄糖濃度同樣不利于0.2～0.4 mm區(qū)間的菌球生成和漆酶的合成，F(xiàn)ang 等的研究也表明當葡萄糖濃度超過一定的范圍，較高的滲透壓促使菌體生長率和產(chǎn)物都降低[10]。

圖2 不同濃度的營養(yǎng)因子對阿魏蘑產(chǎn)漆酶的影響Fig.2 Effect of different concentration of nutritional factors on morphology and laccase of P.ferulae.(A)Glucose.(B) Corn meal.(C) Wheat bran powder.(D)Wheat bran draw-off juice.

2.2.2 玉米粉濃度對菌球形態(tài)和產(chǎn)漆酶的影響

玉米粉濃度對菌球直徑分布和漆酶合成的影響見圖2B。當玉米粉濃度較低時，菌球在0.2～0.4 mm 的區(qū)間所占比例較小，當玉米粉濃度為20 g/L 時，該區(qū)間的比例為34%，此時的漆酶酶活為2367.6 U/L。由結(jié)果得出，阿魏蘑菌球的形態(tài)和漆酶酶活都受到玉米粉濃度的影響，隨玉米粉濃度的增加，直徑在0.2～0.4 mm 范圍內(nèi)的菌球比例也有所增加。

2.2.3 麩皮粉及其汁對菌球形態(tài)和產(chǎn)酶的影響

向基礎培養(yǎng)基中分別添加麩皮粉和麩皮浸出汁后發(fā)現(xiàn)，均有助于0.2～0.4 mm 區(qū)間菌球的形成，隨著添加濃度的增加，0.2～0.4 mm 區(qū)間的菌球比例不斷增加(圖2C,D)。同時，漆酶酶活也相應提高，在40 g/L 濃度下的麩皮粉和麩皮浸出汁，漆酶酶活分別達到5033.3 U/L 和3160.1 U/L。由此可見，麩皮粉和麩皮浸出汁對于漆酶的合成和0.2～0.4 mm區(qū)間菌球的形成均具有促進作用，這再次表明直徑分布在0.2～0.4 mm 范圍的菌球?qū)ζ崦傅暮铣捎兄匾绊憽?/p>

在靈芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)多糖的研究中，麩皮的添加有利于較小直徑的菌球形成，同時提高多糖的產(chǎn)量[11]。本研究中，麩皮粉和麩皮浸出汁對阿魏蘑的菌體形態(tài)和漆酶合成同樣有促進作用，這可能是由于麩皮中含有的營養(yǎng)物質(zhì)，既有利于阿魏蘑的生長，同時還有誘導漆酶合成的作用。雖然麩皮粉與麩皮浸出汁的營養(yǎng)成分相似，但添加麩皮粉對漆酶合成的促進作用要優(yōu)于麩皮浸出汁。而切開阿魏蘑菌球后發(fā)現(xiàn)，菌球內(nèi)部含有麩皮顆粒，這表明麩皮粉不僅為阿魏蘑的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，而且還是菌球形成時的附著點，促進了菌球的形成。

2.3 非營養(yǎng)載體對菌球形態(tài)和酶活的影響

將滑石粉和蒙脫石作為載體加入基礎培養(yǎng)基中，菌球直徑分布和漆酶酶活結(jié)果見圖3A，B。結(jié)果顯示，滑石粉和蒙脫石的添加能使0.2～0.4 mm區(qū)間菌球的比例維持在較高水平，但對阿魏蘑漆酶酶活的影響不大。改變兩種載體的濃度對0.2～0.4 mm 區(qū)間菌球的比例影響不大，對漆酶合成也無明顯的促進作用。

對于絲狀微生物而言，其菌體形態(tài)對于調(diào)控目的產(chǎn)物的合成有著重要意義，van Wezel 等[12]學者由此提出了“形態(tài)工程(Morphological Engineering)”的概念；Oncu 等[13]的研究表明，外部環(huán)境如pH、溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速等是影響醬油曲酶菌體形態(tài)的重要因素；而Driouch 等[14]的研究則發(fā)現(xiàn)通過添加滑石粉或氧鋁土控制菌球直徑的大小，可以有效增加黑曲霉呋喃果糖苷酶的產(chǎn)量。

圖3 不同濃度的滑石粉和蒙脫石對阿魏蘑產(chǎn)漆酶的影響Fig.3 Effect of different concentration of talc and montmorillonite on morphology and laccase of P.ferulae.(A) Talc.(B) Montmorillonite.

在本研究中，通過營養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)控，有效控制了阿魏蘑菌球的大小，形成適合產(chǎn)漆酶的菌體形態(tài)。而在添加滑石粉和蒙脫石的實驗中，雖能夠有效控制菌球直徑，但并沒有促進漆酶合成，推斷滑石粉和蒙脫石作為剛性顆粒，在調(diào)控菌球大小的時候，在一定程度上造成菌絲體的損失，影響了正常的代謝。由此可以看出：1)“形態(tài)工程”的手段并不是促進目的產(chǎn)物合成的本質(zhì)、內(nèi)在因素，只有在不影響微生物正常生長代謝的前提下才能實現(xiàn)發(fā)酵水平的提高；2)雖然控制菌球形態(tài)的手段很多，但是針對特定的絲狀微生物菌種，需要有特定的調(diào)控手段。這對我們今后在絲狀真菌菌體形態(tài)控制的研究方面提供了很好的借鑒。

3 結(jié)論

在本研究中，通過添加玻璃珠發(fā)現(xiàn)，阿魏蘑液態(tài)發(fā)酵過程中菌體形態(tài)對漆酶的合成具有重要影響，表現(xiàn)為球狀菌體產(chǎn)酶能力優(yōu)于絲狀和絮狀菌體。培養(yǎng)基成分直接影響菌球直徑的分布，直徑在0.2～0.4 mm 區(qū)間菌球的比例對漆酶酶活具有一定的影響。研究表明雖然控制菌球形態(tài)的手段很多，但是針對特定的絲狀微生物菌種，需要有特定的調(diào)控手段。

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