楊超，郝寧，嚴(yán)明，高璐，許琳

南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京 210009

丁二酸作為四氫呋喃(THF)、1,4-丁二醇、γ-丁內(nèi)酯等重要化學(xué)品的生產(chǎn)原料，具有良好的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益，市場(chǎng)潛力約245000 t/年，被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)等[1-2]。以可再生資源為原料的發(fā)酵法產(chǎn)丁二酸具有反應(yīng)條件溫和、能耗低、污染少且能固定二氧化碳減少溫室效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[3]。盡管已報(bào)道多種微生物可以發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，但大多數(shù)生產(chǎn)菌在簡(jiǎn)單培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng)，用于培養(yǎng)的有機(jī)氮源以及產(chǎn)物純化的費(fèi)用昂貴[4]。作為背景最為清楚，各領(lǐng)域研究和應(yīng)用最多的微生物Escherichia coli[5-6]，經(jīng)過國(guó)內(nèi)外大量的研究工作，可使E.coli 產(chǎn)丁二酸的產(chǎn)量達(dá)到較高水平[7]，但E.coli 對(duì)高濃度底物(如葡萄糖和NH4+等)及產(chǎn)物耐受性較差，發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸過程需要補(bǔ)充大量的Na2CO3或MgCO3等高成本碳酸鹽，增加了生產(chǎn)成本和后續(xù)處理的難度。

為實(shí)現(xiàn)低成本生物法制備丁二酸，獲得培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、耐受性強(qiáng)、副產(chǎn)物少及丁二酸產(chǎn)率高的菌種成為了關(guān)鍵問題。谷氨酸棒桿菌是一種生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，具有高滲透壓、高糖、高鹽的耐受力，能夠利用多種碳水化合物作為發(fā)酵底物的革蘭氏陽(yáng)性菌，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)氨基酸、核苷酸等，在生產(chǎn)價(jià)格低廉的丁二酸工藝中，有較明顯的優(yōu)勢(shì)[8]。谷氨酸棒桿菌全基因組測(cè)序的完成，推動(dòng)了基因工程定向改造谷氨酸棒狀桿菌的進(jìn)程[9]。日本科學(xué)家Yukawa 研究發(fā)現(xiàn)C.glutamicum R 在厭氧條件下，雖然生長(zhǎng)停滯但保留了主要的代謝功能[10]，能夠利用葡萄糖合成乳酸、丁二酸及乙酸，通過基因工程改造及發(fā)酵優(yōu)化，最終提高丁二酸產(chǎn)量[11]。

C.glutamicum主要通過葡萄糖形成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和丙酮酸，在羧化酶作用下合成草酰乙酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，經(jīng)蘋果酸及富馬酸，最終生成丁二酸。在此過程中最主要限制因素為NADH 的供給[6]。

異檸檬酸裂解酶(ICL)是許多以乙酸鹽和脂肪酸為碳源的微生物進(jìn)行乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵限速酶[12]。異檸檬酸裂解酶在谷氨酸棒狀桿菌中的活性很低[13]，而在E.coli 中的活性較高[12]，可催化異檸檬酸產(chǎn)生琥珀酸和乙醛酸，改變碳流的流向，使其進(jìn)入乙醛酸循環(huán)。通過乙醛酸途徑，每消耗2 mol 的乙酰輔酶A 和1 mol 的草酰乙酸產(chǎn)生1 mol 的丁二酸和1 mol 的蘋果酸，蘋果酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為丁二酸，既能提高丁二酸產(chǎn)率，又能減少乙酸形成。1 mol 葡萄糖通過兩條合成途徑(草酰乙酸-蘋果酸途徑和乙醛酸途徑)最優(yōu)代謝流分布，有可能實(shí)現(xiàn)生成1.71 mol 丁二酸理論產(chǎn)率[14]。而該方面的研究報(bào)道在C.glutamicum 的研究中較為少見，因此我們?cè)贑.glutamicum SA001中誘導(dǎo)表達(dá)來自大腸桿菌的異檸檬酸裂解酶，引入乙醛酸代謝途徑，提高代謝過程中輔酶NADH 含量，增加由乙醛酸循環(huán)途徑到丁二酸的代謝流，考察丁二酸產(chǎn)量及產(chǎn)率的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌 DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保藏；質(zhì)粒pXMJ19由本實(shí)驗(yàn)室保藏；C.glutamicum SA001由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑

氯霉素、基因組提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)、質(zhì)粒小量快速提取試劑盒為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA 片段回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶、DNA 聚合酶和T4 DNA 連接酶為大連寶生物有限公司產(chǎn)品；酵母提取物和胰蛋白胨為Oxoid 公司產(chǎn)品；其余為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 ICL 基因的克隆

引物設(shè)計(jì)：參照來源于E.coli K12基因組的ICL基因序列設(shè)計(jì)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。并分別在上下游引物的5'端引入了Hind Ⅲ和SmlⅠ的酶切位點(diǎn)。PCR 反應(yīng)體系：模板DNA (50 ng/μL)1μL；dNTPs (1 mmol/L)4μL；上下游引物(100 pmol/μL)各1μL；DNA 聚合酶(2.5 U/μL)0.5μL；5倍緩沖液10μL；ddH2O 32.5μL，總體積50μL。反應(yīng)程序設(shè)計(jì)：98℃變性5 min；98℃變性10 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

純化后的ICL 基因片段以及質(zhì)粒pXMJ19用SmaⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，把雙酶切后得到的產(chǎn)物在16℃下經(jīng)T4 DNA 連接酶作用連接12 h 以上，在E.coli DH5α中轉(zhuǎn)化構(gòu)建重組質(zhì)粒pXMJ19-aceA。經(jīng)含氯霉素平板涂布后挑選抗性克隆，然后提取質(zhì)粒并進(jìn)行Hind Ⅲ單酶切及SmaⅠ/Hind Ⅲ的雙酶切鑒定。

1.2.3 重組異檸檬酸裂解酶在谷氨酸棒狀桿菌SA001中的誘導(dǎo)表達(dá)

利用電穿孔法進(jìn)行菌體轉(zhuǎn)化。有氧誘導(dǎo)：30℃、220 r/min 培養(yǎng)菌體到OD600約0.9左右，加入IPTG至終濃度為0.3 mmol/L，30℃、220 r/min 誘導(dǎo)10 h。

1.2.4 酶活檢測(cè)

具體方法依照參考文獻(xiàn)[13]。

1.2.5 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.0，氯霉素、氨芐青霉素的終濃度分別為20μg/mL、100μg/mL。

種子與好氧發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，尿素2.5 g/L，K2HPO4·3H2O 1.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO40.4 g/L，Mn2+0.02 g/L，F(xiàn)e2+0.02 g/L，ZnCl2100μL，CuSO420μL，CaCl220μL，生物素100μg/L，VB1200μg/L (400μL)，pH 為7.0。

厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L ，K2HPO4·3H2O 1.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO40.4 g/L，Mn2+0.02 g/L，F(xiàn)e2+0.02 g/L，ZnCl2100μL，CuSO420μL，CaCl220μL，生物素100μg/L，VB1200μg/L (400μL)，pH 為7.0。

1.2.6 培養(yǎng)條件與方法

有氧搖瓶發(fā)酵：將保藏菌種于LB 固體抗性培養(yǎng)基活化，30℃培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)至500 mL 搖瓶中，30℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。3%接種量接種于500 mL 搖瓶中，加入0.5‰ IPTG，30℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。

厭氧搖瓶發(fā)酵：將菌液全部轉(zhuǎn)至搖管中，7000 r/min 離心3 min，棄上清。用厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基將菌泥充分混勻，轉(zhuǎn)入100 mL 搖瓶中，充入氮?dú)?，添?8 g/L 碳酸氫鈉，30℃、220 r/min 振蕩，厭氧培養(yǎng)16 h。

厭氧補(bǔ)料分批發(fā)酵：補(bǔ)料培養(yǎng)基為20 g/L 葡萄糖、28 g/L 碳酸氫鈉，在給定時(shí)間進(jìn)行補(bǔ)料。

1.2.7 發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析

菌體密度是用紫外可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm 處測(cè)吸光度值，細(xì)胞干重(DCW)是由DCW與OD600測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到，換算公式為：DCW(g/L)=0.4×OD600。培養(yǎng)基中的葡萄糖用DNS 法檢測(cè)，有機(jī)酸用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)，色譜柱為Thermo Organic Acid，流動(dòng)相為50 mmol/L KH2PO4(pH 2.8)，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 異檸檬酸裂解酶(ICL)的克隆與表達(dá)

將PCR 擴(kuò)增后的目的基因片段aceA 和載體pXMJ19分別進(jìn)行EcoRⅠ/Hind Ⅲ雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA 連接酶連接，構(gòu)建表達(dá)載體pXMJ19-aceA。

重組質(zhì)粒經(jīng)單酶雙切鑒定，結(jié)果與預(yù)期一致。經(jīng)測(cè)序確定目的基因序列與公開的序列匹配率為100%。

重組菌與對(duì)照菌經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)好氧培養(yǎng)總蛋白的SDS-PAGE 分析如圖1所示?？梢钥闯鯥CL蛋白成功表達(dá)，大小約43 kDa，與預(yù)期一致。

2.2 ICL 酶活測(cè)定

30℃、220 r/min 培養(yǎng)菌體至OD600=0.9，加入IPTG 至終濃度為0.8 mmol/L，30℃、220 r/min 誘導(dǎo)10 h 后對(duì)出發(fā)菌株和構(gòu)建的重組菌株進(jìn)行粗酶液的相應(yīng)酶活測(cè)定，計(jì)算出粗酶液的比酶活，結(jié)果如表1所示。

2.3 厭氧發(fā)酵

將重組菌株有氧培養(yǎng)至細(xì)胞干重達(dá)到9.6 g/L，洗菌后轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵瓶中(細(xì)胞干重約為9 g/L)，加入28 g/L 碳酸氫鈉，通氮?dú)猓?0℃、220 r/min 培養(yǎng)，進(jìn)行厭氧發(fā)酵。厭氧發(fā)酵16 h，取樣測(cè)OD600、殘?zhí)?、酶活并留樣測(cè)有機(jī)酸含量。通過厭氧發(fā)酵16 h，葡萄糖消耗為14.84 g/L，丁二酸濃度達(dá)到10.38 g/L，丁二酸的得率為0.7 g/g 葡萄糖，丁二酸的生產(chǎn)強(qiáng)度為0.83 g/(L·h)。厭氧16 h 后，出發(fā)菌ICL 的酶活為0.13 U/mL，比酶活為0.12 U/mg；重組菌ICL 的酶活依然維持在較高的水平為0.75 U/mL，比酶活為0.45 U/mg，約為出發(fā)菌株的5.8倍(表2)。

2.4 不同初始糖濃度對(duì)C.glutamicum SA001/pXMJ19-aceA 厭氧發(fā)酵糖耗速率的影響

葡萄糖不但為菌體生長(zhǎng)提供原料，還為厭氧發(fā)酵生成丁二酸提供碳源。因此谷氨酸棒狀桿菌對(duì)葡萄糖的利用率、消耗速率直接與丁二酸的產(chǎn)率相關(guān)。重組菌株經(jīng)好氧培養(yǎng)12 h 后，經(jīng)洗菌后細(xì)胞干重達(dá)9 g/L，在給定碳酸氫鈉濃度的條件下，轉(zhuǎn)入含有不同糖濃度(10、20、30、40和50 g/L)的搖瓶中，通入氮?dú)猓?0℃、220 r/min 培養(yǎng)，進(jìn)行厭氧發(fā)酵。特定時(shí)間取樣，測(cè)生物量、殘?zhí)羌坝袡C(jī)酸。結(jié)果由圖2可知，不同初始糖濃度對(duì)菌的糖耗速率、產(chǎn)酸速率的影響不太明顯，生物量也基本維持在9.6 g/L；初步選擇最佳初始糖濃度為20 g/L，葡萄糖的消耗速率為0.93 g/(L·h)，丁二酸的產(chǎn)率為0.65 g/(L·h)。

2.5 厭氧補(bǔ)料分批發(fā)酵

重組菌株好氧培養(yǎng)12 h，經(jīng)洗菌后細(xì)胞干重達(dá)9 g/L，轉(zhuǎn)入搖瓶中，通入氮?dú)猓?0℃、220 r/min培養(yǎng)，進(jìn)行厭氧發(fā)酵。給定時(shí)間補(bǔ)加葡萄糖和碳酸氫鈉，厭氧發(fā)酵持續(xù)96 h，取樣測(cè)OD600、殘?zhí)遣⒘魳訙y(cè)有機(jī)酸含量。通過厭氧發(fā)酵96 h，葡萄糖消耗為74.84 g/L，乙酸濃度達(dá)到11 g/L，丁二酸濃度達(dá)到55 g/L，丁二酸的得率為0.73 g/g 葡萄糖(圖3)，除此還積累丙酮酸2 g/L，α-酮戊二酸2 g/L，乙醛酸1 g/L，極少量的富馬酸。

圖1 重組菌與對(duì)照菌蛋白電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombiant strains and the original strains.1:the recombiant strains;2:the original strains.

表1 對(duì)照菌與重組菌的蛋白濃度、ICL 酶活及比酶活Table 1 Concentration of protein,enzyme activity and specific enzyme activity of ICL in the control strain and in the recombinant strain

表2 C.glutamicumSA001/pXMJ19和谷氨酸棒狀桿菌SA001/pXMJ19-aceA 厭氧發(fā)酵過程中ICL 酶活、葡萄糖的攝取速率、丁二酸與乙酸的摩爾比和丁二酸的生產(chǎn)速率的對(duì)比Table 2 Comparision of enzyme activity of ICL,glucose uptake rate,succinate titre/acetate titre and succinate production rate between C.glutamicum SA001/pXMJ19 and C.glutamicum SA001/pXMJ19-aceA in anaerobic fermentation process

圖2 不同初始糖濃度對(duì) C.glutamicum SA001/pXMJ19-aceA 厭氧發(fā)酵過程菌體干重(■)、糖耗速率(◆)和產(chǎn)酸速率(▲)的影響Fig.2 Effect of DCW (■)，sugar consumption rate (◆) and the production of succinate (▲) in C.glutamicum SA001/pXMJ19-aceA anaerobic fermentation process.

圖3 谷氨酸棒狀桿菌SA001/pXMJ19-aceA 厭氧補(bǔ)料發(fā)酵過程中的細(xì)胞干重、葡萄糖及產(chǎn)物濃度Fig.3 DCW,the concentrations of glucose and the organic acids in C.glutamicum SA001/pXMJ19-aceA after anaerobic batch fermentation.DCW:dry cell weight.

3 結(jié)果與討論

本研究構(gòu)建了重組谷氨酸棒狀桿菌 SA001/pXMJ19-aceA，有氧條件下酶活比出發(fā)菌提高了7倍，并在厭氧發(fā)酵過程中仍然保持一定活性[15]。經(jīng)厭氧發(fā)酵16 h，葡萄糖消耗14.84 g/L，丁二酸濃度達(dá)到10.38 g/L。丁二酸與乙酸的摩爾比為2.2，相對(duì)于出發(fā)菌株提高了69%，說明過量表達(dá)異檸檬酸裂解酶可以增加由乙醛酸途徑流向丁二酸的代謝流。

好氧階段通過添加終濃度為0.8 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)異檸檬酸裂解酶在谷氨酸棒狀桿菌SA001中表達(dá)，在厭氧發(fā)酵16 h 后，重組菌中的異檸檬酸裂解酶酶活是出發(fā)菌株的6.2倍，盡管丁二酸和蘋果酸都對(duì)異檸檬酸裂解酶有一定的抑制作用[16]。重組菌在厭氧搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵96 h 積累丁二酸55 g/L，相對(duì)于出發(fā)菌株提高了15%；乙酸濃度為11 g/L，占有機(jī)酸總量的15.5%，占副產(chǎn)物總量的68.8%，說明僅通過過量表達(dá)丁二酸生成途徑的關(guān)鍵酶，不能有效降低副產(chǎn)物的含量，還需敲除或抑制副產(chǎn)物(如乙酸)合成途徑，進(jìn)一步減少流向副產(chǎn)物的代謝流，降低產(chǎn)量，并增加丁二酸的產(chǎn)量[17]；僅過量表達(dá)異檸檬酸裂解酶只能激活谷氨酸棒狀桿菌部分乙醛酸循環(huán)途徑，還需過量表達(dá)蘋果酸合成酶打通整個(gè)乙醛酸循環(huán)，并有希望降低副產(chǎn)物乙酸的含量[18]。

通過過量表達(dá)異檸檬酸裂解酶進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸，重組菌丁二酸的產(chǎn)量、生產(chǎn)能力相對(duì)于出發(fā)菌分別提高48%和29%，但仍有不少副產(chǎn)物，可進(jìn)一步通過代謝途徑的改造和優(yōu)化，增加流向丁二酸的代謝流通量，過量表達(dá)蘋果酸合成酶的工作正在進(jìn)行中。

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