馮潔，倫永志，李越，武會娟，李寶明，魏玲，張小莉，王雪蕾，遲慶

1 大連大學醫(yī)學院遼寧省高校生物物理學重點實驗室，遼寧大連 116622

2 大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連 116622

3 北京市理化分析測試中心，北京 100094

癌癥病變過程中最重要的步驟是腫瘤細胞的浸潤和轉移，其關鍵取決于腫瘤細胞的某種分泌物能夠水解細胞外基質(Extra cellular matrix,ECM)和基底膜(Basement membranem,BM)。腫瘤細胞先分泌尿激酶型纖溶酶原激活物(Urokinase-type plasminogen activator,uPA)，此激活物為一種絲氨酸蛋白酶，可激活纖溶酶原產生纖溶酶(Plasmin,PLM)；PLM 繼而降解ECM，同時還能激活前基質金屬蛋白酶成為基質金屬蛋白酶，后者參與細胞外基質蛋白的水解作用；最終ECM 與BM 被水解，腫瘤細胞得以擴散[1]。因此，干預uPA 水平或功能可以達到治療腫瘤的目的，其中尤以Kazal 型絲氨酸蛋白酶抑制因子抑制uPA 活性最為直接也最具有臨床應用前景[2-4]。

本實驗室利用SSH 技術研究HBV RT/DNA聚合酶反式調節(jié)靶基因，從肝母細胞瘤細胞系HepG2中篩選得到一未知功能新基因，經(jīng)RT-PCR 驗證及生物信息學方法確定該基因屬于一種新的Kazal 型Serpin，命名為Hespintor

(GenBank Accession No.DQ438947)。Hespintor cDNA 全長為285個核苷酸，編碼94個氨基酸。蛋白質序列分析表明，Hespintor 編碼的94個氨基酸可分為3部分：N 端1～23個氨基酸殘基為信號肽；第35～94個氨基酸含一個典型的Kazal結構域；N 端信號肽與Kazal 結構域間的24～34位氨基酸殘基構成了連接區(qū)[5]。

pET-40b(+)原核表達載體具有2個顯著特點：一是含有T7啟動子，可被宿主細胞提供T7 RNA聚合酶識別，T7 RNA 聚合酶的轉錄效率比大腸桿菌RNA 聚合酶高5倍，能夠高效轉錄mRNA，并大量表達融合蛋白；二是載體上攜帶Dsbc·Tag、His·Tag 和S·Tag，誘導表達的35 kDa 標簽蛋白對目的蛋白的結構及生物學活性影響很小，特別是分別位于目的蛋白前后的His·Tag 為進一步純化重組融合蛋白提供了最佳親和位點，而且兩者之間有凝血酶(Thrombin)及腸激酶(Enterokinase)酶切位點，便于純化后將標簽蛋白切除。

本研究將從 HepG2細胞中克隆得到的Hespintor Kazal 型結構域編碼區(qū)亞克隆至原核表達載體pET-40b(+)中，采用IPTG 誘導帶有融合標簽蛋白的Hespintor-Kazal 重組蛋白的大量表達。經(jīng)誘導條件的優(yōu)化篩選，獲得Hespintor-Kazal 重組融合蛋白的高效表達，再經(jīng)Ni2+柱及Q 柱兩步純化及柱上復性，最終得到具有特異性抑制胰蛋白酶水解活性的純化重組蛋白，為下一步的研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒及菌株

pMD 20-T/Hespintor cDNA 克隆載體、大腸桿菌 DH5α為本實驗室保存；大腸桿菌Rosetta(DE3)、原核表達載體pET-40b(+)引自北京市理化分析測試中心；pMD 19-T Simple Vector 購自寶生物工程(大連)公司。

1.1.2 引物

根據(jù) Hespintor 基因序列(GenBank Accession No.DQ438947)，設計序列特異性的含有限制性核酸內切酶(BamH Ⅰ/Hind Ⅲ)酶切位點的引物F (5′-GGATCCGCCTAAGCCCCG-3′)、R (5′-GCGCAAGCTTATCACATTTTCCAT ATTTTTC-3′)，由寶生物工程(大連)公司合成。

1.1.3 主要試劑

Restriction Enzyme Starter BOX、Permix Ex Taq Version 2.0、λ-Hind Ⅲ digest 、DL2000 DNA Marker 購自寶生物工程(大連)公司；PageRuler Prestained Protein Ladder 購自美國Fermentas 公司；鼠抗人His·Tag 單克隆抗體(一抗)購自科百奧公司；羊抗鼠HRP-IgG (二抗)購自中杉金橋公司；牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶(活性≥250 NF U/mg)購自美國Amresco 公司；Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽酸鹽(BAPNA)購自美國Sigma 公司；Ni2+柱(Ni2+-Histrap FF crude 5 mL)、Q 柱(Histrap Q FF column 1 mL)購自美國GE Healthcare 公司；考馬斯亮藍G250購自索萊寶公司。

1.2 方法

1.2.1 pET-40b(+)/Hespintor-Kazal 原核表達載體的構建和鑒定

以pMD 20-T/Hespintor cDNA 克隆質粒為模板，PCR 擴增Hespintor Kazal 型結構域編碼序列，3%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠純化回收。將純化的目的基因片段與 pMD 19-T Simple Vector 室溫連接過夜，轉化DH5α感受態(tài)細胞，堿裂解法提取質粒后測序鑒定，證明目的基因片段已正確插入T載體中；再用BamH Ⅰ/Hind Ⅲ從T 載體上酶切目的基因片段，3%瓊脂糖凝膠電泳純化回收，與經(jīng)過同樣酶切的pET-40b(+)原核表達載體連接，轉化大腸桿菌 Rosetta(DE3)，堿裂解法提取質粒后酶切鑒定。

1.2.2 Hespintor-Kazal 重組融合蛋白的誘導表達及條件優(yōu)化

轉化有 pET-40b(+)/Hespintor 的 Rosetta(DE3)菌株接種至 LB 液體培養(yǎng)基(氯霉素34μg/mL、卡那霉素10μg/mL)中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，按比例擴大培養(yǎng)，選擇不同誘導條件進行優(yōu)化，分別觀察誘導時間、IPTG 終濃度、誘導溫度對目的蛋白表達量的影響，每個條件做3組平行。離心收集菌體，15% SDS-PAGE進行分析，確定最適誘導條件。

1.2.3 Hespintor-Kazal 重組融合蛋白的純化復性與鑒定

利用Western blotting 確定重組蛋白的表達。將最適條件誘導獲得的菌體(上清保留備用)超聲破碎，用8 mol/L 尿素溶液溶解沉淀(即包涵體)，離心后收集上清。用A 液(8 mol/L 尿素,0.5 mol/L NaCl,20mmol/L 咪唑；pH 8.0)平衡Ni2+柱，上清抽濾脫氣后上柱，A 液繼續(xù)沖洗，用B 液(0.5 mol/L NaCl,20 mmol/L 咪唑；pH 8.0)進行蛋白復性，梯度洗脫程序由0% B 至100%B，復性時間為150 min。該過程中將融合蛋白液從8 mol/L 尿素緩慢降至0 mol/L 尿素，變性的融合蛋白重新折疊形成具有生物活性的空間結構，即柱上復性，整個過程在低溫環(huán)境下進行。尿素去除完全后用C 液(0.5 mol/L NaCl,500 mmol/L 咪唑；pH 8.0)進行洗脫，收集洗脫峰，15% SDS-PAGE 分析。用D 液(20 mmol/L Tris-HCl；pH 8.0)平衡Q 柱，將Ni2+柱純化后的樣品用D 液稀釋后上樣，用E 液(20 mmol/L Tris-HCl,1 mol/L NaCl；pH 8.0)進行梯度洗脫，收集洗脫峰，15% SDS-PAGE 分析。Bradford法測定重組蛋白濃度。

1.2.4 Hespintor-Kazal 重組融合蛋白的活性鑒定

參照文獻[6-7]和Sigma 公司活性測定方法，進行部分改進：取8只5 mL 離心管分別編號，其中7只各加入40μg/mL 胰蛋白酶200μL，依次加入0、20、40、80、120、160、200μL 重組蛋白純化液；余下的1只離心管中加入20μL 1 mmol/L HCl 作為空白對照，用Tris-HCl 均補至2 mL，37℃水浴10 min，8只管各加入1 mL 1 mmol/L BAPNA，37℃水浴5 min，加入1 mL 60%醋酸終止反應。595 nm 處檢測OD 值。根據(jù)下列公式計算Hespintor-Kazal 重組融合蛋白的抑制率，繪制抑制曲線。

2 結果

2.1 Hespintor-Kazal 原核表達載體的構建

圖1 Hespintor Kazal 結構域編碼序列的PCR 產物Fig.1 PCR products of CDS of Hespintor Kazal domain.M:DL500 DNA marker;1–3:PCR products of Hespintor.

以pMD 20-T/Hespintor cDNA 克隆質粒為模板，利用PCR 方法擴增Hespintor Kazal 型結構域編碼序列，產物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在197 bp 處附近可見擴增產物(圖1)，大小與預期相符。純化后的PCR 產物與T 載體連接后經(jīng)藍白斑篩選和雙酶切鑒定得到陽性重組子pMD 19-T Simple/Hespintor-Kazal，測序結果表明目的基因片段已正確插入至T 載體中。用BamH Ⅰ/Hind Ⅲ雙酶切T 載體得到的目的基因片段連接至經(jīng)過同樣酶切的pET-40b(+)，酶切鑒定結果表明重組原核表達載體 pET-40b(+)/Hespintor-Kazal 構建成功(圖2)。

2.2 Hespintor-Kazal 重組融合蛋白表達條件的篩選

pET-40b(+)/Hespintor-Kazal 重組載體轉化大腸桿菌Rosetta (DE3)，經(jīng)誘導表達后進行15%SDS-PAGE 分析，在相對分子量約42 kDa 處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，與預期相符。表達條件的篩選結果表明，誘導時間對Hespintor-Kazal 重組融合蛋白表達量無明顯影響，但誘導5 h 的表達量相對較多；IPTG 濃度對重組蛋白表達量亦無明顯影響，由于高濃度IPTG 對細菌有毒副作用，因此選擇0.25 mmol/L 作為IPTG 誘導濃度；誘導溫度只有在33℃時重組蛋白表達量較少，考慮到溫度對菌體生長的影響，故選擇30℃作為誘導溫度(圖3)。誘導產物離心后獲得的上清和沉淀經(jīng)15% SDS-PAGE 分析，結果證實Hespintor-Kazal 重組融合蛋白以包涵體形式存在于沉淀中(圖4)，約占菌體總蛋白量25.83%。進一步的Western blotting 檢測表明，重組蛋白可與His 單克隆抗體發(fā)生特異性結合(圖5)。

2.3 Hespintor-Kazal 重組融合蛋白的純化復性與鑒定

將包涵體溶液進行組氨酸親和層析，Hespintor-Kazal 重組融合蛋白經(jīng)柱上復性后被洗脫，通過監(jiān)控蛋白洗脫曲線，洗脫下來的目的蛋白出現(xiàn)明顯的單一紫外吸收峰(圖6A)。SDS-PAGE 結果顯示經(jīng)Ni2+柱純化后的蛋白主要以兩條條帶遷移，尚有少量雜蛋白，故將親和層析純化產物再進行陰離子交換層析(圖6B)，經(jīng)SDS-PAGE 檢測，最終得到目的蛋白的單一特異性條帶(圖7)。經(jīng)Bradford 法測定，純化蛋白濃度為193.678μg/mL，即每升誘導表達菌液經(jīng)超聲破碎與Ni2+柱及Q 柱兩步純化后可獲得0.77 mg Hespintor-Kazal 重組融合蛋白。

圖2 重組原核表達載體 pET-40b(+)/Hespintor-Kazal 的酶切鑒定Fig.2 Identification of pET-40b(+)/Hespinto-Kazal by enzyme digestion.M1:λ-Hind Ⅲ digest;1:pET-40b(+)/Hespintor-Kazal;2–4:pET-40b(+)/Hespintor-Kazal digested with BamH Ⅰand Hind Ⅲ;5:PCR products of Hespintor-Kazal;6:pET-40b(+) digested with BamHⅠ and Hind Ⅲ;M2:DL2000 DNA marker.

圖3 誘導溫度對Hespintor-Kazal 重組融合蛋白表達量的影響Fig.3 Effect of induced temperature on the expression of Hespintor recombinant protein.1:Rosetta (DE3)induced;2:Rosetta(DE3)/pET-40b(+) induced;M:PageRular prestained protein ladder;3:Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal non-induced;4–7:Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal induced with different temperature (24℃,27℃,30℃,33℃).

圖4 誘導產物粗提取物的溶解性分析Fig.4 Solubility analysis of crude extracts from induced Rosetta(DE3).(A) M:PageRular prestained protein ladder;1:inclusion body of Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal;2:periplasm parts of Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal;3:supernatant of Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal.(B)1:Rosetta(DE3)/pET-40b(+)induced;2:Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal non-induced;3:inclusion body of Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal sloved in 8 mol/L urea;4:inclusion body of Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal.

圖5 Hespintor-Kazal 重組融合蛋白的 Western blotting 鑒定Fig.5 Identification of purified Hespintor recombinant protein by Western blotting.M:PageRular prestained protein ladder; 1:Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal non-induced; 2:Rosetta(DE3)/pET-40b(+) induced;3–5:Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal induced with different IPTG concentration(0.25,0.50,0.75 mmol/L).

2.4 Hespintor-Kazal 重組融合蛋白的活性鑒定

胰蛋白酶(Trypsin)可水解BAPNA 生成無色的苯甲酰-L-精氨酸和淡茶色的對硝基苯胺，使溶液變成淡茶色。若在此系統(tǒng)中加入過量的胰蛋白酶抑制劑，抑制胰蛋白酶的水解活性，底物不能水解生成對硝基苯胺，溶液仍呈現(xiàn)無色。結果表明，隨著蛋白濃度的上升，Hespintor-Kazal 重組融合蛋白對胰蛋白酶的抑制率也隨之上升，當?shù)鞍缀繛?8.74 mg/mL時，胰蛋白酶的抑制率達到91.57%。由此可見，Hespintor-Kazal 重組融合蛋白對胰蛋白酶具有較高的抑制作用，并且抑制曲線呈劑量依賴關系(圖8)。

圖6 Ni2+柱(A)和Q 柱(B)純化Hespintor-Kazal 重組融合蛋白的洗脫曲線Fig.6 Elution curve of Hespintor recombinant protein from Ni2+ column(A) and Q column(B).

圖7 Ni2+柱及Q 柱純化Hespintor-Kazal 重組融合蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of purified Hespintor recombinant protein from Ni2+ column and Q column.M:PageRuler prestained protein ladder;1:purified Hespintor recombinant protein from Ni2+ column;2:purified Hespintor recombinant protein from Q column.

圖8 純化的Hespintor-Kazal 重組融合蛋白對胰蛋白酶活性的抑制作用Fig.8 Inhibitory activity of purified Hespintor recombinant protein on trypsin.

3 討論

已有研究表明，腫瘤細胞產生的蛋白酶降解ECM 及基膜的能力與其侵襲、轉移能力密切相關。蛋白酶的活性可由多個層次進行調控[8-10]，但最直接的方法還是阻斷蛋白酶活性。在此級聯(lián)式反應中，uPA 發(fā)揮著關鍵性作用，被認為是腫瘤局部浸潤和/或形成遠處轉移的限速步驟。盡管可在多個層次上調控蛋白酶活性，但最直接的方法還是阻斷蛋白酶活性[9,11]。因此，干預uPA 水平或功能可成為治療腫瘤的一種有效方法。

SERPIN (Serine proteinase inhibitor)是一類絲氨酸蛋白酶活性調節(jié)因子，根據(jù)它們的序列特征和三維結構，目前歸類為18個非同源蛋白質家族，其中以Kazal 型SERPIN 抑制uPA活性最為直接也最具有臨床應用前景[12-14]。Kazal 型SERPIN 屬于較為保守的家族之一，其成員多為小分子多肽，其中某些成員具有抑制腫瘤細胞增殖和侵襲的活性，從而成為腫瘤治療的新靶點[15-19]。蛋白質序列分析表明，Hespintor 具有與食管癌相關基因2(Esophageal cancer related gene 2，ECRG2)高度同源的serpin 基本結構。由于ECRG2具有抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移等作用，因此提示Hespintor 可能具有同樣的抗腫瘤能力[11,20-22]。

本研究將Hespintor 連接至原核表達載體pET-40b(+)中，采用IPTG 誘導Hespintor-Kazal融合標簽蛋白的大量表達。pET-40b(+)原核表達載體具有兩個顯著特點：一是含有T7啟動子，可被宿主細胞提供T7 RNA 聚合酶識別，T7 RNA 聚合酶的轉錄效率比大腸桿菌RNA 聚合酶高5倍，能夠高效轉錄mRNA，并大量表達融合蛋白；二是載體上攜帶Dsbc·Tag、His·Tag和S·Tag，誘導表達的35 kDa 標簽蛋白對目的蛋白的結構及生物學活性影響很小，特別是分別位于目的蛋白前后的His·Tag 為進一步純化蛋白提供了最佳親和位點，而且兩者之間有凝血酶(Thrombin)及腸激酶(Enterokinase)酶切位點，便于純化后將標簽蛋白切除[23–24]。誘導條件是影響外源蛋白表達的重要因素，誘導溫度、誘導時間和IPTG 濃度是其中不可缺少的，由于三者之間有相互作用，應采用正交試驗來進行優(yōu)化。結果表明，誘導條件的變化對重組蛋白的表達量無太明顯影響。本研究預實驗發(fā)現(xiàn)，即使將IPTG 濃度降至0.1 mmol/L，進行16℃低溫誘導，仍未有效增強重組蛋白的可溶性或提高其表達量。由于單因素實驗結果差異甚微，因此僅采用最佳單因素條件進行重組蛋白的誘導表達。

在蛋白純化復性過程中，首先采用Ni2+柱進行親和層析，獲得的洗脫曲線為單一峰；之后的SDS-PAGE 分析出現(xiàn)兩條蛋白條帶，重組蛋白為42 kDa 的蛋白條帶，另一蛋白條帶分子量約為50 kDa，在純化前的電泳檢測時并未出現(xiàn)。分析認為，該雜蛋白分子量與重組蛋白分子量不成倍數(shù)關系，并非重組蛋白的二聚體或多聚體，有可能是進行重組蛋白復性時重新折疊聚集的速度有時過快，導致某些蛋白碎片通過二硫鍵而隨機聚集形成。SDS-PAGE 分析結果表明，Ni2+柱的上樣流穿液中仍含有部分重組蛋白，說明Ni2+柱對重組蛋白His 標簽的親和力未達到飽和，或是重組蛋白本身結構限制了Ni2+柱對His 標簽的親和力[25-26]。根據(jù)上述分析，選擇500 mmol/L 咪唑直接洗脫Ni2+柱而非梯度洗脫，以便于后繼的蛋白純化。由于預測重組蛋白的理論等電點pI 為7.12，所用緩沖液pH 8.0，故選擇Q 柱進行陰離子交換層析，最終獲得產物為單一條帶的重組蛋白。

本文成功構建了Hespintor-Kazal 原核表達體系，并獲得純化的重組融合蛋白，之后初步證明其具有預期的生物學活性。下一步將重點圍繞Hespintor-Kazal 重組融合蛋白的純化復性工藝及其體內外抗腫瘤活性開展研究。

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