趙許朋，羅克明，周月，吳秀華，楊立，湯紹虎

1 西南大學三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715

2 西南大學生命科學學院，重慶 400715

獼猴桃營養(yǎng)極為豐富，是水果之王[1]。中國是世界獼猴桃起源中心，也是獼猴桃生產大國，有著豐富的獼猴桃遺傳資源[2-3]。至2009年，全國獼猴桃總產量和栽培面積均居世界第一位[3]?！t陽’獼猴桃品質極佳，總糖含量達13.45%，高出世界流行品種‘海沃德’近5%，尤其口感優(yōu)于目前國內外選育的任何品種，堪稱獼猴桃極品[1]。但獼猴桃是雌雄異株植物，采用種子播種等常規(guī)繁殖方式容易造成品種退化，不利于優(yōu)良性狀的保持，限制了優(yōu)良品種的推廣[4-5]，并且獼猴桃在生產栽培中經常發(fā)生潰瘍病等嚴重病害，導致枝條萎蔫、枯死或整株枯死[1,6]，多年調查數據顯示，每年因潰瘍病造成的減產在20%左右[7]。

組織培養(yǎng)方法不僅可以保持品種的優(yōu)良性狀和實現其快速繁殖，而且以此方法為基礎的遺傳轉化技術能將抗病基因導入獼猴桃[8]，為解決獼猴桃病害問題提供了一條新途徑。葉片可經愈傷組織誘導和不定芽分化兩步再生不定芽，也可由葉片一步直接再生。前者再生不定芽周期長，且在誘導過程中易發(fā)生無性系變異[9]；后者對母本的遺傳物質具有“高保真性”，很少發(fā)生變異，是植物基因工程中最好的植株再生和遺傳轉化系統[10]。有關獼猴桃離體再生的研究已有不少報道[4-5,8,11-13]，但對葉片直接再生的研究較少，涉及中華系品種僅2篇[14-15]，其中‘紅陽’獼猴桃僅1篇[14]，且再生頻率還較低，并且在農桿菌介導的遺傳轉化過程中，由于農桿菌的侵染和抗生素的存在，會使再生頻率降低[16-17]。因此，一個高效再生體系的建立是優(yōu)良品種快速工廠化生產和遺傳轉化成功的關鍵[18]。本試驗以‘紅陽’獼猴桃葉片為外植體，通過葉片直接再生和不定芽增殖培養(yǎng)基的篩選以及良好根系的誘導形成建立了高頻再生體系，為‘紅陽’獼猴桃試管苗的工廠化生產和抗病基因工程育種奠定了良好基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為‘紅陽’獼猴桃(Actinidia chinensis cv.‘Red Sun’)雌株當年生枝條，由重慶市綠康果業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉片外植體的獲得

取長約10 cm 苗端，經常規(guī)表面消毒后接種在MS+2 mg/L BA 固體培養(yǎng)基中，(25±2)℃、4500 lx (16 h/d)培養(yǎng)30 d 后，取無菌苗(無根苗)的嫩葉，切成大小約0.5 cm×0.5 cm 的葉盤用于不定芽誘導。

1.2.2 不定芽的誘導與增殖

將葉盤接種在不同不定芽誘導培養(yǎng)基中(表1)，暗培養(yǎng)30 d 后轉入光照培養(yǎng)，10 d 后(共40 d)統計不定芽誘導率和不定芽數量；將叢芽分離，選取長約0.5 cm 的單個不定芽接種在不同增殖培養(yǎng)基中(表2)，30 d 后統計不定芽繁殖系數(培養(yǎng)后單芽總數/接種單芽數)。

1.2.3 不定芽生根

切取長2 cm 以上的不定芽，接種在含不同濃度IBA (表3)的1/2 MS 固體培養(yǎng)基中誘導生根，15 d 后統計生根率和不定根數量。然后轉入充分吸附1/2 MS 液體基本培養(yǎng)基的珍珠巖基質中促進根系發(fā)育，15 d 后(共30 d)檢查根系發(fā)育狀況和用于移栽。

1.2.4 基本培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件

接種過程在無菌條件下(超凈工作臺上)進行。每個培養(yǎng)基接種48個外植體(4個/瓶)，3次重復。所用基本培養(yǎng)基為 MS (生根為1/2 MS)，附加30 g/L 蔗糖、8 g/L 瓊脂，pH 5.8；培養(yǎng)溫度均為(25±2)℃，光照強度4500 lx(16 h/d)。除不定芽誘導階段為暗培養(yǎng)外，其余階段為光照培養(yǎng)。

1.2.5 試管苗移栽

將根系發(fā)育和生長良好的試管苗(高2 cm以上)的培養(yǎng)瓶移出培養(yǎng)室，在室內放置2 d 后逐漸打開瓶蓋，煉苗5 d；取苗，洗凈根系后移栽到盛田間土壤的營養(yǎng)缽中，每天澆適量水，30 d 后統計移栽成活率。

2 結果與分析

2.1 植物生長調節(jié)劑對葉片不定芽再生的影響

葉盤接種后，暗培養(yǎng)10 d 左右，切口開始膨大，葉脈切口明顯膨大；15 d 左右出現芽點(圖1A)；30 d 后芽點發(fā)育成明顯的淺綠色不定芽(圖1B)。光照培養(yǎng)10 d 后(共40 d)，原淺綠色的不定芽轉為深綠色，生長正常(圖1C)。至40 d，在Y5、Y8培養(yǎng)基中，葉盤出芽率均達100%(表1)，且與其他培養(yǎng)基存在顯著差異(P≤0.05)。其中，Y8培養(yǎng)基出芽數最多，平均18.67個/葉盤，并與其他培養(yǎng)基存在顯著差異。因此，在本試驗中，‘紅陽’獼猴桃葉片直接再生的最佳培養(yǎng)基為Y8培養(yǎng)基，即MS+3.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA。試驗結果表明，‘紅陽’獼猴桃葉片的直接再生需要細胞分裂素和生長素的聯合作用。培養(yǎng)基中僅含細胞分裂素(BA)時(Y1～Y3)，葉片外植體僅膨大，不能分化出不定芽；同時含有細胞分裂素和生長素類(NAA)時(Y4～Y9)則可直接產生不定芽。

2.2 植物生長調節(jié)劑對不定芽增殖的影響

在不同增殖培養(yǎng)基中，不定芽接種后，10 d左右開始增殖，增殖率87.5%～100%(表2)。通過連續(xù)6代的繼代培養(yǎng)，Z5培養(yǎng)基的平均繁殖系數最高(8.63)，且不定芽生長健壯，長度普遍在2 cm 以上(圖1D)，利于不定芽生根。因此，在本試驗中，Z5培養(yǎng)基即MS+2 mg/L BA+1.0 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3為‘紅陽’獼猴桃不定芽最佳增殖培養(yǎng)基。

圖1 ‘紅陽’獼猴桃葉片植株再生Fig.1 Plant regeneration from leaf of ‘Red Sun’ kiwifruit (Actinidia chinensis).(A) Adventitious buds directly regenerated from leaves cultured in dark for 15 days.(B) Adventitious buds directly regenerated from leaves cultured in dark for 30 days.(C) Adventitious buds directly regenerated from leaves cultured in light for 10 days.(D) Multiplication of adventitious buds.(E) Rooting of adventitious buds.(F) One acclimatized plantlets after transplanting to the soil condition for 30 days.

表1 植物生長調節(jié)劑對‘紅陽’獼猴桃葉片分化不定芽的影響Table 1 Effects of plant growth regulators on dedifferentiation of buds from leaves of ‘Red Sun’ kiwifruit

表2 植物生長調節(jié)劑對‘紅陽’獼猴桃不定芽增殖的影響Table 2 Effects of plant growth regulators on multiplication of adventitious buds of ‘Red Sun’ kiwifruit

2.3 不定芽生根與試管苗移栽

不定芽在含IBA 的1/2 MS 固體培養(yǎng)基中，3 d 左右不定根開始發(fā)生，之后迅速伸長。歷時15 d 的誘導結果(表3)表明，IBA 含量低于0.8 mg/L 時，生根率、平均根數和根長隨IBA濃度增加而提高；高于0.8 mg/L 時則下降。其中，G3培養(yǎng)基生根效果最好，且不定根具明顯側根。在其誘導生根結束后，在含1/2 MS 液體培養(yǎng)基的珍珠巖基質中不定根得到良好發(fā)育，15 d 后形成龐大根系(圖1E)。因此，在本試驗中，‘紅陽’獼猴桃不定芽生根的最佳方法是：在1/2 MS+0.8 mg/L IBA 固體培養(yǎng)基中誘導不定根發(fā)生，然后在含1/2 MS 液體培養(yǎng)基的珍珠巖基質中促進根系發(fā)育(各15 d)。

經室內馴化和煉苗后，98株試管苗移栽到田間土營養(yǎng)缽中，30 d 成活95株，移栽成活率達96.94%，且生長良好(圖1F)。

3 討論

葉片直接再生不定芽時，可經短暫愈傷階段或不經愈傷階段直接分化形成不定芽[18]。在現有獼猴桃葉片直接再生的報道中，普遍經歷了短暫的愈傷階段[14-15,19-21]，在不定芽誘導培養(yǎng)基中經過或不經過繼代培養(yǎng)一步直接出芽。在本試驗中，葉片外植體也經歷了短暫的愈傷階段，不經繼代直接出芽。

表3 IBA 濃度對‘紅陽’獼猴桃不定芽生根的影響Table 3 Effects of IBA concentration on rooting of adventitious buds of ‘Red Sun’ kiwifruit

在已有獼猴桃葉片直接再生報道中，普遍存在再生頻率和繁殖系數較低等問題。一是出芽時間較長、出芽率較低和出芽數較少。如中華獼猴桃‘紅陽’60 d 出芽率為99.33%，出芽數為5.2個/葉盤[14]，“伏牛95-2”40 d 出芽率和出芽數分別為87.5%和4.2個[15]；美味獼猴桃30～60 d 分別為80%～100%和1.2～15個[19,21-23]；闊葉獼猴桃42 d 分別為76.39%和5.33個[20]；狗棗獼猴桃98 d 分別為68.7%和10個[24]；葛棗獼猴桃40～50 d 分別為58%～93.3%和3.5～5.8個[25-26]。二是普遍未對再生不定芽進行繼代增殖研究，其再生系統的整體繁殖效率不確定。涉及不定芽繼代培養(yǎng)的2篇報道均為中華獼猴桃，但只進行了1次(30～35d)繼代培養(yǎng)，且繁殖系數較低。如‘紅陽’(35 d)繁殖系數為4.50[14]，伏牛95-2(30 d)為4.76[15]；三是不定芽生根率較低。如30 d‘紅陽’生根率為75%[14]，伏牛95-2為86.67%[15]。其他獼猴桃(30 d)有的較低，如美味獼猴桃為60%[19]；有的較高，如美味、闊葉、狗棗和葛棗獼猴桃可達100%[20,22,24-27]。但圖片顯示，所有報道的不定根均為棒狀根，根系不發(fā)達，勢必影響試管苗移栽后的成活和生長，尤其是前期生長。四是進行試管苗移栽試驗的較少，且移栽成活率還較低。如‘紅陽’在珍珠巖與泥炭的混合基質中10 d 成活率為94.67%[14]，美味獼猴桃在溫室內3個月成活率為90%[22]，闊葉、葛棗獼猴桃可移栽到田間或溫室中[20,26]，而成活率不詳。

在本試驗中，葉片再生不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA，經過40 d培養(yǎng)，出芽率達100%，出芽數達18.67個/葉盤；不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基為 MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3，在30 d 的繼代周期中，1～6代平均繁殖系數達8.63；不定芽生根最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+0.8 mg/L IBA，在此培養(yǎng)基中誘導15 d 后，其生根率達100%，經15 d 壯根培養(yǎng)，根系發(fā)達；煉苗后試管苗在田間土營養(yǎng)缽中生長30 d 后，成活率達96.94%。本試驗較好地解決了上文中提到的獼猴桃葉片直接再生中普遍存在的一些問題，建立了‘紅陽’獼猴桃的葉片高頻直接再生體系，可為‘紅陽’獼猴桃試管苗的工廠化生產和抗病基因工程提供良好的技術平臺。

[1]Wang KQ,Zhou JF,Wang XB.Cultivation and management of Red Sun kiwifruit.Shanxi Forest Sci Technol,2010,(5):68-71(in Chinese).汪克強,周建峰,王曉兵.紅陽獼猴桃的栽培與管理.陜西林業(yè)科技,2010,(5):68-71.

[2]Zou Y,Huang M,Hou RT,et al.Analysis on inter-simple sequence repeats in 14 Actinidia varieties.J Southwest China Normal Univ:Natl Sci Ed,2008,33(1):111-115(in Chinese).鄒游,黃敏,侯若彤,等.ISSR 標記技術在獼猴桃遺傳研究中的運用.西南師范大學學報:自然科學版,2008,33(1):111-115.

[3]Han SM,Zhou SX,Song MZ,et al.Market status and the development strategy of kiwifruit industry of China.Heilongjiang Agril Sci,2011,(2):101-106(in Chinese).韓世明,周賽霞,宋滿珍,等.獼猴桃產業(yè)的市場現狀及發(fā)展對策.黑龍江農業(yè)科學,2011,(2):101-106.

[4]Yang XC,Wang BC,Ye ZY,et al.Tissue culture and rapid propagation of Actinidia chinensis.J Chongqing Univ:Natl Sci Ed,2002,25(6):75-77(in Chinese).陽小成,王伯初,葉志義,等.中華獼猴桃的組織培養(yǎng)及其實用快速繁殖.重慶大學學報:自然科學版,2002,25(6):75-77.

[5]Liu CC,Chen ZX,Gong XQ,et al.Studies on optimization of the conditions for in vitro culture and plantlet regeneration of Actinidia chinensis cv.Jin Fu.J Southwest China Normal Univ:Natl Sci Ed,2007,32(5):124-128(in Chinese).劉長春,陳澤雄,龔雪芹,等.金富獼猴桃離體培養(yǎng)與植株再生的優(yōu)化研究.西南師范大學學報:自然科學版,2007,32(5):124-128.

[6]Mi HB,Zhang H,Liu B.Main technologies of pest management on Shaanxi organic kiwi production.Acad Period Farm Products Proc,2007,(3):85-87(in Chinese).米宏彬,張皓,劉斌.陜西省有機獼猴桃生產中的有害生物管理技術要點.農產品加工·學刊,2007,(3):85-87.

[7]Liu ZD,Lü Y.Several problems in kiwifruit production.Northwest Horticulture (Fruits),2011,(4):5-6(in Chinese).劉占德,呂巖.獼猴桃生產中存在的幾個問題.西北園藝(果樹),2011,(4):5-6.

[8]Yan JL,Zhang Y,Xing M,et al.Studies on rapid micro-propagation technique of Actinidia chinensis var.rufopulpa.J Huazhong Agril Univ,2008,27(1):101-104(in Chinese).嚴姜黎,張翼,邢梅,等.紅肉獼猴桃離體快速繁殖技術研究.華中農業(yè)大學學報,2008,27(1):101-104.

[9]Zhang JE,Liu JH,Deng XX.Genetic variation of Citrus calli revealed by the ploidy analyser.Acta Genetica Sin,2003,30(2):169-174(in Chinese).張俊娥,劉繼紅,鄧秀新.采用倍性分析儀鑒定柑橘愈傷組織的遺傳變異.遺傳學報,2003,30(2):169-174.

[10]Ibrahim R,Debergh PC.Factors controlling high efficiency adventitious bud formation and plant regeneration from in vitro leaf explants of roses(Rosa hybrida L.).Sci Horticul,2001,88:41-57.

[11]Fu ZH,Li HL,Li Q,et al.Callus induction and plantlet regeneration from the immature embryo of Actinidia arguta var.purpurea.J Wuhan Bot Res,2004,22(5):459-462(in Chinese).付志惠,李洪林,李瓊,等.紫果獼猴桃幼胚愈傷組織誘導及植株再生.武漢植物學研究,2004,22(5):459-462.

[12]Akbas F,Isikalan C,Namli S.Callus induction and plant regeneration from different explants of Actinidia deliciosa.Appl Biochem Biotechnol,2009,158(2):470-475.

[13]Kim M,Kim S C,Moon D Y,et al.Rapid Shoot propagation from micro-cross sections of kiwifruit (Actinidia deliciosa cv.‘Hayward’).J Plant Biol,2007,50(6):681-686.

[14]Long QJ,Wu YJ,Xie M.Tissue culture and rapid micro-propagation from leaves and stems of kiwifruit (Actinidia chinensis cv.Hongyang).Acta Agri Zhejiangensis,2010,22(4):429-432(in Chinese).隆前進,吳延軍,謝鳴.‘紅陽’獼猴桃葉片和帶芽莖段的組織培養(yǎng)快繁技術.浙江農業(yè)學報,2010,22(4):429-432.

[15]Shang XL,Ma CH,Feng JC,et al.Establishment of regeneration system from leaves of Actinidia chinensis.Acta Agri Jingxi,2010,22(4):50-52(in Chinese).尚霄麗,馬春華,馮建燦,等.中華獼猴桃葉片再生體系的建立.江西農業(yè)學報,2010,22(4):50-52.

[16]Cao Y,Niimi Y,Hu SL.Meropenem as an alternative antibiotic agent for suppression of Agrobacterium in genetic transformation of Orchid.Agri Sci China,2006,5(11):839-846.

[17]Wu YQ,Cheng HH,Li YS,et al.Effects of antibiotics on in vitro leaves regeneration of apple.J Hebei Agri Sci,2012,16(2):55-58(in Chinese).吳雅琴,程和禾,李玉生,等.抗生素對蘋果離體葉片再生的影響.河北農業(yè)科學,2012,16(2):55-58.

[18]Chen H,Li P,Liu J,et al.Establishment and optimization of the regeneration system for common dandelion (Taraxacum officinale Weber).Chin J Biotech,2005,21(2):244-249(in Chinese).陳華,李平,劉晶,等.藥蒲公英再生體系的建立和優(yōu)化.生物工程學報,2005,21(2):244-249.

[19]Fan JF,Li L,Han YF,et al.Establishment of leaf regeneration system in Kiwifruit (Qinmei).Acta Bot Boreali-Occidentalia Sin,2002,22(4):907-912(in Chinese).樊軍鋒,李玲,韓一凡,等.秦美獼猴桃葉片最佳再生系統的建立.西北植物學報,2002,22(4):907-912.

[20]Bi JH,Liu YL,Syed Asghar.In vitro organogenesis and plant regeneration from leaf explants of Actinidia latifolia.J Fruit Sci,2005,22(4):405-408(in Chinese).畢靜華,劉永立,Syed Asghar.闊葉獼猴桃葉片離體器官發(fā)生和植株再生.果樹學報,2005,22(4):405-408.

[21]Tian N,Xu ZQ,He JG.Establishment of high frequency and direct regeneration system of kiwifruit (Actinidia deliciosa Qinmei).J Wuhan Bot Res,2007,25(1):79-83(in Chinese).田娜,徐子勤,何近剛.獼猴桃高頻直接再生體系的建立.武漢植物學研究,2007,25(1):79-83.

[22]Prado MJ,Gonzalez MV,Romo S,et al.Adventitious plant regeneration on leaf explants from adult male kiwifruit and AFLP analysis of genetic variation.Plant Cell Tiss Organ Cult,2007,88:1-10.

[23]Zhou LY,Qin HM,Lai XY,et al.Establishmentof regeneration system of kiwifruit seedlings.Guihaia,2009,29(4):514-517(in Chinese).周玲艷,秦華明,賴幸韻,等.獼猴桃實生苗再生體系的建立.廣西植物,2009,29(4):514-517.

[24]Lan DW,Liu YL,Yuan TL.Organogenesis,somatic embryogenesis and plantlet regeneration from leaf explants of Actinidia kolomikta cultured in vitro.J Fruit Sci,2007,24(2):218-222(in Chinese).蘭大偉,劉永立,原田隆.狗棗獼猴桃葉片離體培養(yǎng)的器官、體細胞胚形成與植株再生.果樹學報,2007,24(2):218-222.

[25]Sugawara F,Yamamoto N,Tanaka O.Plant regeneration in in vitro culture of leaf,stem and petiole segments of Actinidia polygama Miq.Plant Tissue Cul Lett,1994,11(1):14-18.

[26]Takahashi W,Sugawara F,Yamamoto N,et al.Plant regeneration in Actinidia polygama Miq.by leaf,stem,and petiole culture with zeatin,and from stem-derived calli on low-sucrose medium.J Forestry Res,2004,9(1):85-88.

[27]Liu YL,Lan DW,Bi JH,et al.Organ formation and plant regeneration in vitro of Actinidia polygama.J Fruit Sci,2005,22(3):220-223(in Chinese).劉永立,蘭大偉,畢靜華,等.葛棗獼猴桃組織培養(yǎng)中的器官形成與植株再生.果樹學報,2005,22(3):220-223.