霍孝雨，諸葛斌，方慧英，宗紅，宋健，諸葛健

1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122

2 江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無錫 214122

他汀類藥物作為羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶(HMGR)競爭性抑制劑，可以有效抑制膽固醇合成，降低血清膽固醇，是臨床上常用降血脂藥物[1-2]。研究人員一直致力于尋找更加高效的他汀類物質(zhì)，其中利用微生物轉(zhuǎn)化是一個(gè)重要的途徑，如嗜碳鏈霉菌Streptomyces carbophilus、馬杜拉放線菌Actinomadura sp.可將美伐他汀轉(zhuǎn)化為普伐他汀[3-4]。無錫他汀作為具有我國獨(dú)立自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型他汀，由 Amycolatopsis sp.CGMCC1149轉(zhuǎn)化洛伐他汀而來，其對HMGR 的抑制效果是洛伐他汀的4倍[5]。國內(nèi)對他汀的生物轉(zhuǎn)化研究很少，因此研究開發(fā)無錫他汀有助于打破國外在他汀方面的壟斷。

細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，P450)是一類自然界廣泛存在的羥基化酶，屬于含硫醇-血紅素的單加氧酶，因其還原型與一氧化碳(CO)復(fù)合物在450 nm 處有特征吸收峰而得名[6-7]。本研究室前期研究表明， Amycolatopsis sp.CGMCC1149細(xì)胞蛋白中包含具有P450特性的蛋白，并且洛伐他汀轉(zhuǎn)化與此酶酶活變化存在一定關(guān)聯(lián)，該轉(zhuǎn)化過程也可被CO 所抑制，初步推測洛伐他汀羥基化由P450催化完成[8-9]。為獲得該羥基化酶，本文從Amycolatopsis sp.CGMCC1149中克隆得到其基因并在大腸桿菌E.coli 中表達(dá)，同時(shí)建立了一個(gè)體外酶催化功能驗(yàn)證系統(tǒng)，首次實(shí)現(xiàn)無錫他汀轉(zhuǎn)化底物洛伐他汀的體外羥基化，為無錫他汀大規(guī)模制備奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Amycolatopsis sp.CGMCC1149，E.coli JM109，E.coli DH5α及表達(dá)載體pEtac 由本研究室保藏；克隆載體pMD18-T，PCR 相關(guān)試劑，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ購自大連TaKaRa公司；洛伐他汀購自浙江海正藥業(yè)；鐵氧還蛋白(ferredoxin)和鐵氧還蛋白還原酶(ferredoxin reductase)購自Sigma-Aldrich 公司；質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒購自北京博大泰克；引物由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成；基因測序由北京六和華大基因完成。

1.2 方法

1.2.1 羥基化酶基因的克隆

對NCBI 公布的部分放線菌細(xì)胞色素P450基因(GenBank Accession No.AB208694,AB426710,AY549201)進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)存在保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)簡并引物用于擴(kuò)增羥基化酶的保守區(qū)片段。采用Self-Formed Adaptor PCR (SEFA PCR)[10]技術(shù)克隆羥基化酶的側(cè)翼序列。引物設(shè)計(jì)見表1，其中引物DP-F和DP-R 用于擴(kuò)增保守區(qū)序列，引物3SP1、3SP2、3SP3用于擴(kuò)增3′側(cè)翼序列，5SP1、5SP2、5SP3用于擴(kuò)增5′側(cè)翼序列。SEFA PCR 反應(yīng)條件參照參考文獻(xiàn)[10]。

1.2.2 產(chǎn)羥基化酶重組菌 E.coli DH5α(pEtac-p450lov)的構(gòu)建

根據(jù)獲得的羥基化酶基因序列，設(shè)計(jì)一對引物P-F 和P-R，分別在兩引物5′端引入EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，“_”表示加入的酶切位點(diǎn)(表1)。PCR 程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，65℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR 產(chǎn)物回收后，與質(zhì)粒pEtac 同時(shí)用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，回收目的片段經(jīng)T4 DNA 連接酶連接得到 pEtac-p450lov。將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入 E.coli DH5α，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒驗(yàn)證，即得重組菌E.coli DH5α(pEtac-p450lov)。

表1 本文所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3 重組羥基化酶的誘導(dǎo)表達(dá)

1.2.4 體外酶催化系統(tǒng)

體外酶催化系統(tǒng)：0.3 mmol/L 洛伐他汀，0.5 mmol/L NADH，320μg 鐵氧還蛋白，0.04 U鐵氧還蛋白還原酶，羥基化酶樣品，總體積200μL。30℃、150 r/min 水浴反應(yīng)30 min，105℃、5 min終止反應(yīng)，HPLC 檢測反應(yīng)產(chǎn)物。檢測條件為：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)，流動(dòng)相甲醇-0.5%乙酸(80∶20)，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20μL，檢測波長237 nm，柱溫25℃。

2 結(jié)果

2.1 羥基化酶基因的克隆

圖1 羥基化酶基因克隆路線示意圖Fig.1 Schematic diagram of hydroxylase gene cloning.

圖2 PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Results of PCR.(A) Degenerate PCR.(B)5′-flanking SEFA PCR.(C)3′-flanking SEFA PCR.(D)Amplification of the whole hydroxylase gene.M:λ-Hind III digest DNA marker;1:PCR product.

運(yùn)用簡并PCR 和SEFA PCR 技術(shù)克隆羥基化酶基因，克隆過程如圖1所示。根據(jù)P450的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對簡并引物并進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到約0.5 kb 的片段并測序(圖2A)。測序得到524 bp的基因片段，將其提交NCBI 進(jìn)行比對，比對結(jié)果表明該片段與 P450基因的相似性高。根據(jù)此片段，設(shè)計(jì)兩組SEFA PCR 引物，分別用于擴(kuò)增其5′和3′側(cè)翼序列，經(jīng)過兩輪SEFA PCR，分別得到5′側(cè)翼約4.1 kb(圖2B)和3′側(cè)翼約2.3 kb基因片段(圖2C)。將上述得到的片段進(jìn)行測序并拼接，根據(jù)拼接結(jié)果設(shè)計(jì)一對引物P-F 和P-R，PCR 擴(kuò)增得到約1.2 kb 的片段(圖2D)，測序結(jié)果表明該片段為一個(gè)完整開放閱讀框，包含1212 bp，編碼一個(gè)含403個(gè)氨基酸的蛋白，蛋白理論等電點(diǎn)為4.7，理論分子量為44.8 kDa。

將該基因序列在NCBI 中進(jìn)行Blast 比對，發(fā)現(xiàn)與P450基因相似性高，其中與遠(yuǎn)青色擬無枝酸菌 Amycolatopsis azurea 的 P450Um-1(GenBank Accession No.AB208694)[12]的最高(91%)。將該基因編碼的氨基酸序列提交細(xì)胞色素 P450工程數(shù)據(jù)庫(http://www.cyped.unistuttgart.de/)中CYP 模塊(CYP modules)進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測[13]，結(jié)果如圖3所示。該蛋白共含有11個(gè)α-螺旋，4個(gè)β-折疊，一個(gè)曲折環(huán)(Meander loop)和一個(gè)Cys 袋區(qū)(Pocket)，其中β1含5股(Strand)，β2含2股，β3含2股，β4含2股。另外，此蛋白包含幾個(gè)P450典型功能區(qū)，其中[243SHET]為氧結(jié)合區(qū)(Oxygen binding site)，位于螺旋I，與分子氧的結(jié)合有關(guān)[14]；[281EMLR]為離子對結(jié)合區(qū)(Ion-pair region)，位于螺旋K，主要與電子傳遞鏈相互作用及血紅素結(jié)合有關(guān)[15]；[345FGHGIHQCLG]為血紅素結(jié)合區(qū)(Heme binding region)，位于Cys 袋區(qū)中，其中Cys 完全保守，與血紅素第5配位鍵結(jié)合[16]。因此，可以確定所克隆的基因?qū)儆赑450基因超家族，并將其命名為 p450lov，編碼的蛋白命名為P450Lov，所得的核酸序列及氨基酸序列提交GenBank，基因登錄號為KC352683。

2.2 產(chǎn)羥基化酶重組菌 E.coli DH5α(pEtac-p450lov)的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

根據(jù)已得羥基化酶基因序列，設(shè)計(jì)一對引物進(jìn)行PCR 得到p450lov 基因片段，并將其插入到pEtac，得到重組質(zhì)粒pEtac-p450lov(圖4A)。對構(gòu)建好的質(zhì)粒pEtac-p450lov 進(jìn)行酶切及PCR 驗(yàn)證，結(jié)果表明p450lov 成功連接到pEtac 上(圖4B)。將重組質(zhì)粒pEtac-p450lov 導(dǎo)入E.coli DH5α，得到重組菌 E.coli DH5α(pEtacp450lov)，對其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以E.coli DH5α(pEtac)為對照。不同培養(yǎng)溫度(20℃、25℃、30℃、37℃)下重組P450Lov 表達(dá)結(jié)果如圖5所示，20℃時(shí)P450Lov 主要集中在破壁上清液中，以可溶性形式存在，隨著溫度升高上清液中逐漸減少而破壁沉淀中逐漸增多，當(dāng)溫度達(dá)到37℃時(shí)，P450Lov 主要集中在破壁沉淀，以包涵體形式存在，上清液明顯減少。破壁上清液的CO 示差光譜表明(圖6)，在450 nm 處有明顯特征吸收峰，說明重組P450Lov 正確折疊表達(dá)，以活性形式存在，其表達(dá)量為2.17 nmol/g。

圖3 羥基化酶的二級結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structure of hydroxylase.

圖4 重組質(zhì)粒pEtac-p450lov 的構(gòu)建及驗(yàn)證Fig.4 Construction and analysis of recombinant plasmid pEtac-p450lov.(A) Recombinant plasmid pEtac-p450lov.(B) Analysis of pEtac-p450lov by restriction enzyme digestion and PCR.M1:λ-Hind III digest DNA marker;M2:DL2000 DNA marker;1:plasmid pEtac-p450lov was digested with EcoR I;2:plasmid pEtac-p450lov was digested with EcoR I and Hind III;3:p450lov gene was PCR amplified using pEtac-p450lov as the template.

圖5 羥基化酶的SDS-PAGE 檢測Fig.5 SDS-PAGE analysis of hydroxylase.1:lysate supernatant of E.coli DH5α(pEtac);2–5:lysate supernatant of E.coli DH5α(pEtac-p450lov) cultured at 20℃,25℃,30℃,37℃;6–9:lysate precipitant of E.coli DH5α(pEtac-p450lov) cultured at 20℃,25℃,30℃,37℃;M:protein marker.

2.3 羥基化酶的體外催化

利用1.2.4中所述的系統(tǒng)，對羥基化酶進(jìn)行催化功能驗(yàn)證，結(jié)果表明重組P450Lov 可以借助該系統(tǒng)將洛伐他汀羥基化為3-羥甲基洛伐他汀(圖7B)，而對照組E.coli DH5α(pEtac)細(xì)胞破壁上清液則無3-羥甲基洛伐他汀形成(圖7A)。由上述結(jié)果證實(shí)，在Amycolatopsis sp.CGMCC1149中催化洛伐他汀羥基化的反應(yīng)由P450Lov 催化完成。同時(shí)，利用該體系可以實(shí)現(xiàn)洛伐他汀的體外羥基化，這為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)無錫他汀的體外轉(zhuǎn)化打下了基礎(chǔ)。

圖6 羥基化酶的CO 示差光譜Fig.6 CO difference spectrum of hydroxylase.

3 討論

Amycolatopsis sp.CGMCC1149轉(zhuǎn)化洛伐他汀過程中，高濃度洛伐他汀對菌體有一定毒害作用，從而限制無錫他汀產(chǎn)量的提高，其中利用相關(guān)酶進(jìn)行無錫他汀體外轉(zhuǎn)化是解決此不利影響的手段之一。

P450在自然界分布廣泛，催化的典型反應(yīng)是通過電子傳遞系統(tǒng)，將分子氧還原，并伴隨底物的羥基化[17]。雖然在E.coli 中沒有發(fā)現(xiàn)P450存在[18]，但有些P450可以借助E.coli 的內(nèi)生電子傳遞系統(tǒng)來行使完整的催化功能，如灰色鏈霉菌Streptomyces griseus 的CYP105D1和一些來自人體的P450[19-20]。為了使P450Lov具備催化洛伐他汀的能力，本文首先嘗試?yán)肊.coli 的內(nèi)生電子傳遞系統(tǒng)來重組P450Lov 的催化活性，結(jié)果表明P450Lov 并不能借助該系統(tǒng)來催化洛伐他汀的羥基化。對于細(xì)菌來源的P450，一般可用來源菠菜的鐵氧化蛋白和鐵氧還蛋白還原酶代替自身電子傳遞系統(tǒng)來行使催化功能[21]。據(jù)此本文再次嘗試?yán)描F氧化蛋白和鐵氧還蛋白還原酶來建立洛伐他汀的體外羥基化系統(tǒng)。檢測結(jié)果表明，利用該系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)洛伐他汀的體外羥基化，這也直接證實(shí)了Amycolatopsis sp.CGMCC1149轉(zhuǎn)化洛伐他汀過程中的羥基化酶即為細(xì)胞色素P450。

圖7 洛伐他汀羥基化產(chǎn)物的HPLC 檢測Fig.7 HPLC analysis of lovastatin hydroxylated product.(A) Control group.(B) Experimental group.(C) Adding of 3-hydroxymethyl lovastatin standard.

為進(jìn)一步提高該系統(tǒng)的催化效率，需要對Amycolatopsis sp.CGMCC1149自身電子傳遞系統(tǒng)展開更多的研究。此外，本文所建立的體外酶催化系統(tǒng)只是實(shí)現(xiàn)了洛伐他汀的體外羥基化，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)無錫他汀體外轉(zhuǎn)化，需要對轉(zhuǎn)化過程中另一個(gè)關(guān)鍵酶——異構(gòu)酶進(jìn)行研究。

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