靳國杰，楊曉兵，沈宏偉，王雅南，龔志偉，趙宗保

1 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)部，遼寧大連 116023

2 大連潔凈能源國家實(shí)驗(yàn)室(籌)生物能源研究部，遼寧大連 116023

3 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

為應(yīng)對化石能源枯竭和環(huán)境日益惡化，世界各國采取的重要舉措之一是大力發(fā)展可再生能源。其中，生物柴油具有能量密度高、潤滑性能好、儲(chǔ)運(yùn)安全、抗爆性好、燃燒充分、可再生、環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)，可直接應(yīng)用于現(xiàn)有的柴油發(fā)動(dòng)機(jī)系統(tǒng)和油料輸送系統(tǒng)，是最理想的生物燃料之一[1]。當(dāng)前生物柴油的原料主要是動(dòng)、植物油脂。微生物油脂是微生物在一定條件下發(fā)酵生產(chǎn)的油脂，又稱單細(xì)胞油脂，通常具有和植物油脂相近的脂肪酸組成[2]。與植物油脂技術(shù)相比，微生物油脂技術(shù)具有生產(chǎn)周期短、可連續(xù)供給、生產(chǎn)潛力大等優(yōu)勢，且不與人爭糧，不與糧爭地。微生物油脂是解決生物柴油產(chǎn)業(yè)原料問題最有效、可持續(xù)的途徑之一[3]。

由于現(xiàn)有技術(shù)不成熟、生產(chǎn)成本高，微生物油脂還沒有得到廣泛應(yīng)用。簡化下游工藝，降低油脂提取能耗和成本是解決微生物油脂工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵之一。微生物油脂發(fā)酵醪液水分含量高(水分含量占80%以上)、細(xì)胞尺寸小、細(xì)胞密度低、物料粘度高[4]。為了獲得干細(xì)胞，發(fā)酵醪液需經(jīng)過濾、離心、干燥等脫水工序，能耗占整個(gè)下游能耗的85%以上[5]。所以基于干細(xì)胞的油脂提取方法，如壓榨法、壓力溶劑法[6]、索氏提取法等由于能耗過大，很難大規(guī)模應(yīng)用。為降低能耗，可直接用有機(jī)溶劑處理濕細(xì)胞提取油脂[7-8]，但通常使用甲醇、氯仿等毒性較大的溶劑。超臨界流體雖然可以替代上述溶劑[9]，但需在高溫高壓下操作，設(shè)備要求高。采用毒性較小的有機(jī)溶劑，如正己烷、乙酸乙酯等，處理濕細(xì)胞油脂提取效果差。這是因?yàn)檫@些溶劑透膜性能差，不能有效地進(jìn)入細(xì)胞萃取胞內(nèi)油脂。

通過適當(dāng)?shù)姆椒▽⒓?xì)胞破碎，可顯著提高油脂提取效率[10]。文獻(xiàn)報(bào)道有酸熱法、微波輔助法、超聲波輔助法、高壓蒸汽法、高壓均質(zhì)法、玻璃珠破碎法、滲透壓法和酶輔助法等[11-17]。酸熱法酸性強(qiáng)，易造成油脂水解，酸值升高，并且廢水易污染環(huán)境。酸熱法還易破壞高附加值副產(chǎn)物如類胡蘿卜素等，降低產(chǎn)品品質(zhì)。微波輔助法、超聲波輔助法、高壓蒸汽法、高壓均質(zhì)法和玻璃珠破碎法能耗高，不適合工業(yè)化應(yīng)用。

酶輔助油脂提取法通過酶水解細(xì)胞壁，提高油脂浸提效率，可適用于高水分環(huán)境，操作條件溫和，已廣泛應(yīng)用于植物油脂提取[18]。有研究者在微藻菌泥中加入蝸牛酶和胰蛋白酶，油脂提取率達(dá)到49.8%[16]。圓紅冬孢酵母Rhodosporidium toruloides 產(chǎn)油性能良好，在限氮培養(yǎng)條件下，胞內(nèi)油脂可占生物量70%以上[19]。與微藻不同，R.toruloides 屬于擔(dān)子菌門，細(xì)胞壁最外層含有大量β-1,3-葡甘露聚糖，該糖主鏈?zhǔn)怯善咸烟桥c甘露糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成，側(cè)鏈由11～16個(gè)單糖通過β-1,3糖苷鍵與主鏈連接而成。β-1,3-葡甘露聚糖酶(MAN5C)能夠水解β-1,3-葡甘露聚糖中相鄰于β-1,4糖苷鍵的β-1,3糖苷鍵[20]。在前期工作中，考察了處理?xiàng)l件、溶劑、溫度、pH 及酶用量等條件對從R.toruloides Y4發(fā)酵醪液中萃取油脂效率的影響；在優(yōu)化條件下，以乙酸乙酯為溶劑，油脂提取率達(dá)到96.6%[17]。本文將其反應(yīng)體系放大至10 L 規(guī)模，考察酶輔助提取R.toruloides 油脂的效果和穩(wěn)定性，為其工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

圓紅冬孢酵母 Rhodosporidium toruloides Y4是R.toruloides AS 2.1389經(jīng)玉米秸稈水解液馴化所得。R.toruloides AS 2.1389購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

畢赤巴斯德酵母Pichia pastoris (X-33)為異源表達(dá)β-1,3-葡甘露聚糖酶的宿主菌株，購自Invitrogen 公司(美國)。

1.2 培養(yǎng)基

YEPD 液體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10。固體培養(yǎng)基在YEPD 液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入15 g/L 瓊脂粉。

R.toruloides Y4批式發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60.6，酵母粉10，(NH4)2SO410，KH2PO41，MgSO4·7H2O 1。滅菌后按1%(V/V)加入已過濾除菌的微量元素母液[21]。

BMGY 液體培養(yǎng)基(g/L)：甘油10，酵母粉10，蛋白胨20，YNB 13.4，生物素4×10～4，0.1 mol/L 的磷酸鉀緩沖體系(pH 6.0)。

Pichia pastoris 批式發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：CaSO40.93，K2SO418.2，MgSO4·7H2O 14.9，KOH 4.13，甘油40。每升培養(yǎng)基中加入26.7 mL 85% H3PO4。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 制備重組β-1,3-葡甘露聚糖酶(plMAN5C)

利用工程菌株畢赤巴斯德酵母 Pichia pastoris X-33在15 L 發(fā)酵罐上表達(dá)plMAN5C[22]。發(fā)酵液在4℃、11397×g 下離心1 h，所得上清先用6層普通濾紙抽濾，再用孔徑為0.22μm 濾膜抽濾，凍干。所得plMAN5C酶粉的酶活為460 U/g。plMAN5C 酶粉酶活按照文獻(xiàn)方法測定，酶活單位的定義為：酶反應(yīng)體系在37℃、pH 4.5的條件下，每分鐘釋放10μg 還原糖所需的酶量為1 U[22]。

1.3.2 酶處理R.toruloides Y4發(fā)酵醪液

R.toruloides Y4在15 L 發(fā)酵罐上批式補(bǔ)料發(fā)酵[23]，得生物量為124.3 g/L、油脂量為75.0 g/L、含水量為84.1%(W/W)的發(fā)酵醪液。取10 L 發(fā)酵醪液，用5 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH至6.0，水浴加熱至90℃，保溫15 min，之后水浴冷卻至25℃。按照已優(yōu)化的條件[17]向發(fā)酵液中加入46.5 g plMAN5C 酶粉，用8 mol/L HCl調(diào)pH 至4.0，25℃下攪拌3 h。

1.3.3 發(fā)酵醪液油脂萃取

用5 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)酶處理后R.toruloides Y4發(fā)酵醪液的pH 至6.0，加入10 L乙酸乙酯，室溫下攪拌4 h，轉(zhuǎn)速為600 r/min。在11397×g 下離心10 min (以下同)，取出有機(jī)相和清液，向乳化相中加入8 L 乙酸乙酯，攪拌1 h，離心，分出有機(jī)相和清液，向乳化相中再加入5 L 乙酸乙酯，攪拌1 h，離心，分出有機(jī)相和清液。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量測定

將R.toruloides Y4發(fā)酵醪液在6200×g 下離心5 min，菌體用去離子水洗滌2次，在世凱105℃下烘至恒重，以g 干菌體/L 發(fā)酵液表示菌體生物量。

1.4.2 發(fā)酵醪液油脂量測定

采用酸熱法[11]提取發(fā)酵液總油脂，以g 油/L發(fā)酵液表示油脂量，作為衡量酶輔助法油脂提取率的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.3 酶處理過程中油脂提取率測定

在1.3.2酶處理過程中，每隔0.5 h，取出5 mL 發(fā)酵醪液，加入10 mL 乙酸乙酯，振蕩混勻5 min，在9700×g 下離心10 min (以下同)，取有機(jī)相，余相中加入10 mL 乙酸乙酯，振蕩混勻5 min，離心，取有機(jī)相，將2次萃取得到的有機(jī)相合并，用等體積0.1% NaCl 溶液洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，在105℃下烘至恒重。所得油脂量與標(biāo)準(zhǔn)油脂量比較，得油脂提取率。

1.4.4 萃取過程中油脂提取率測定

在1.3.3的第一次萃取過程中，每隔0.5 h，取出10 mL，在6200×g 下離心5 min，取有機(jī)相，余相在9700×g 下離心10 min，取有機(jī)相。將兩次離心得到的有機(jī)相合并，用等體積0.1%NaCl 溶液洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，在105℃下烘至恒重。所得油脂量與標(biāo)準(zhǔn)油脂量比較，得油脂提取率。

1.4.5 萃取過程中乳化率測定

在1.3.3的第1次萃取過程中，每隔0.5 h，取出10 mL，在6200×g 下離心5 min，取有機(jī)相，余相在9700×g 下離心10 min，取有機(jī)相，將兩次離心得到的有機(jī)相合并，測定體積。乳化率(%)=(Vt–Vf)/ Vt×100(Vt：萃取溶劑總體積，mL；Vf：離心所得的萃取溶劑體積，mL)。

1.4.6 多次萃取的油脂提取率測定

將1.3.3的第1次萃取得到的有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的油脂量與標(biāo)準(zhǔn)油脂量比較，得單次萃取的油脂提取率。同樣，將第2次、第3次萃取得到的有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的油脂量與之前得到的油脂量相加，與標(biāo)準(zhǔn)油脂量比較，先后得萃取2次、3次的總油脂提取率。

1.4.7 多次萃取的溶劑回收率測定

測定1.3.3的第1次萃取得到的有機(jī)相體積，與加入的乙酸乙酯的體積比較，得第1次萃取的溶劑回收率。同樣，測定第2次和第3次萃取得到的有機(jī)相體積，與之前萃取得到的有機(jī)相體積相加，并與累計(jì)使用乙酸乙酯的體積比較，先后得萃取2次、3次的總?cè)軇┗厥章省?/p>

1.4.8 清液干物質(zhì)量的測定

將1.3.3萃取過程所得全部清液混合，取樣品在105℃下烘至恒重，稱重計(jì)算清液干物質(zhì)量。

1.4.9 菌渣量的測定

在1.3.3萃取結(jié)束后，將剩余的菌體和乳狀液混合，在105℃下烘至恒重，稱重得菌渣量。

1.4.10 物料回收率的測定

物料回收率為回收物料的干物質(zhì)量占初始物料干物質(zhì)量的比例。其中，初始物料包括R.toruloides Y4發(fā)酵醪液和過程中加入的酶粉、酸液和堿液，回收的物料包括提取到的油脂、清液和菌渣。

1.4.11 油脂脂肪酸組成及酸值分析

取油脂樣品，按文獻(xiàn)方法測定酸值[24]，并進(jìn)行甲酯化和脂肪酸組成分析[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶處理時(shí)間對油脂提取的影響

微生物油脂是胞內(nèi)產(chǎn)物，被細(xì)胞壁和細(xì)胞膜所包裹，直接用有機(jī)溶劑萃取，效率不高。為提高效率，需要破碎細(xì)胞壁。產(chǎn)油酵母R.toruloides Y4細(xì)胞壁主要成分為β-1,3-葡甘露聚糖，可被MAN5C 水解。在前期工作中，通過工程菌表達(dá)獲得了重組的plMAN5C[22]。在10 mL 規(guī)模下，R.toruloides Y4發(fā)酵醪液分別經(jīng)plMAN5C 發(fā)酵上清和透析過的plMAN5C 酶液處理，油脂提取率分別達(dá)到93.5%和96.6%[17]。酶處理的前1 h 是酶解效率主導(dǎo)油脂提取率的階段。前0.5 h 油脂提取率從75.6%增加到82.3%，其后趨于穩(wěn)定。本文在10 L 規(guī)模研究酶輔助微生物油脂提取法。發(fā)現(xiàn)隨著酶處理時(shí)間增加，油脂提取率逐漸增加(圖1)，說明細(xì)胞壁酶解程度逐漸增加。酶處理3 h，油脂提取率達(dá)到81.1%。其中，前0.5 h 油脂提取率的提高很快，從33.2%增加到71.1%，說明這段時(shí)間plMAN5C 酶解效率很高。這與10 mL 體系的規(guī)律類似，說明放大酶解體系沒有影響酶解效率，提取工藝的酶處理階段穩(wěn)定性高。

2.2 萃取時(shí)間對油脂提取和乳化的影響及乳化層的破除

圖1 酶處理時(shí)間對油脂提取率的影響Fig.1 Effect of enzymatic treatment time on lipid extraction yields.

在酶處理3 h 后，向發(fā)酵醪液加入等體積乙酸乙酯，攪拌混勻，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵醪液與乙酸乙酯形成穩(wěn)定的乳狀液，靜置1 h 不分層。這是因?yàn)榧?xì)胞壁水解釋放出胞內(nèi)蛋白質(zhì)、糖脂、磷脂等兩性物質(zhì)，作為表面活性劑分布在乙酸乙酯、油脂等有機(jī)相和水相之間的界面層中，降低了界面張力，形成了乳液。乳化現(xiàn)象將嚴(yán)重影響油脂提取[25]。增加萃取時(shí)間，有機(jī)相和水相接觸更加充分，乳液更加穩(wěn)定，乳化率增加，油脂提取率降低(圖2)。當(dāng)萃取1 h 時(shí)，乳化率達(dá)到44.7%，油脂提取率降低到46.4%，此后趨于穩(wěn)定。在充分酶解的情況下，油脂提取率與乳化率呈反相關(guān)。要獲得好的油脂提取效果，必須降低乳化率。

圖2 萃取時(shí)間對油脂提取率和乳化率的影響Fig.2 Effect of extraction time on lipid extraction yields and emulsification yields.

降低乳化率的方法很多，最常用的是離心破乳和酶破乳[26]。提高離心加速度或者增加離心時(shí)間可以破除乳化層，但是能耗高。利用蛋白酶、磷脂酶水解蛋白質(zhì)和磷脂等表面活性物質(zhì)可以降低乳化率，但成本高。本文采用多次萃取的方來破除乳化層，提高油脂提取率。使用乙酸乙酯第1次萃取的油脂提取率和溶劑回收率分別只有29.0%和30.0%(圖3)，此時(shí)體系乳化程度高，油脂提取率低。通過移除清液，補(bǔ)加乙酸乙酯，2次萃取的總油脂提取率和總?cè)軇┗厥章史謩e達(dá)到87.6%和86.1%；而3次萃取后分別達(dá)到92.9%和87.0%，已接近于10 mL 規(guī)模的最優(yōu)值。在多次萃取過程中，移除清液降低了體系中蛋白質(zhì)和磷脂等生物表面活性劑含量。補(bǔ)加乙酸乙酯促進(jìn)乳滴合并，降低乳化層穩(wěn)定性，從而提高了油脂提取率和溶劑回收率。在實(shí)際生產(chǎn)中，離心得到包含乙酸乙酯和油脂的有機(jī)相由于遠(yuǎn)未達(dá)到油脂溶解度，可直接用于下一輪萃取。這樣可減少有機(jī)溶劑使用量，降低溶劑回收能耗。

2.3 酶輔助提取油脂的工藝流程和物料衡算

圖3 萃取次數(shù)對總油脂提取率和總?cè)軇┗厥章实挠绊慒ig.3 Effect of extraction number on total lipid extraction yields and total solvent recovery yields.

圖4 酶輔助法提取R.toruloides 油脂工藝流程圖Fig.4 Enzyme-assisted R.toruloides lipid extraction process flow diagram.a:containing cell mass of 1243.0 g;b:the dry weight.

如圖4所示，酶輔助提取R.toruloides 油脂的工藝流程包括發(fā)酵醪液熱處理、酶處理、萃取、離心分離和溶劑蒸發(fā)。本研究表明全流程的物料回收率達(dá)到94.2%。酶處理、萃取和離心分離都在常溫常壓下進(jìn)行，與酸熱法、高壓蒸汽法、微波輔助法、超臨界萃取法相比，能耗低。由于細(xì)胞和酶易于分散在水相中，萃取操作在低攪拌速率下即可達(dá)到充分混合，與玻璃珠破碎法和高壓均質(zhì)法相比，動(dòng)力消耗低。由于熱處理和酶處理都在發(fā)酵罐中進(jìn)行，沒有使用特殊設(shè)備，與超聲波輔助法相比，設(shè)備使用少，成本低。由于plMAN5C 只選擇性水解細(xì)胞壁中相鄰于β-1,4糖苷鍵的β-1,3糖苷鍵，酶處理后細(xì)胞壁保留了一定的結(jié)構(gòu)完整性[17]，有利于菌體回收利用。由于過程中pH 調(diào)節(jié)幅度小，與酸熱法相比，引入酸堿量少，清液中含鹽量低，便于處理，對環(huán)境污染少。綜上分析，酶輔助提取R.toruloides 油脂工藝的設(shè)備使用少、菌渣回收容易，適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)。

2.4 油脂脂肪酸組成和酸值分析

從表1可以看出，酶輔助法提取油脂的脂肪酸組成與總油脂相似，以棕櫚酸(C16)、棕櫚油酸(C16:1)、油酸(C18:1)、亞油酸(C18:2)和亞麻酸(C18:3)等C16、C18系脂肪酸為主。已有研究表明，R.toruloides Y4油脂含有中性脂、糖脂、鞘脂和磷脂等不同極性的組分，中性脂占81%～88%[27]。在酶輔助提取油脂的過程中，中性脂更易被有機(jī)溶劑萃取，而糖脂、鞘脂和磷脂等極性親水分子分散在水相，形成乳化層，提取率較低[16]。與糖脂、鞘脂、磷脂相比，中性脂的飽和脂肪酸(SFA)含量較高[28]，所以酶輔助法提取的油脂中SFA 較多。采用酸熱法和酶輔助法提取的油脂的酸值分別為(8.3±0.30) mg KOH/g 和(2.9±0.2) mg KOH/g。這可能是因?yàn)槊篙o助法提取油脂操作條件溫和，油脂水解程度低，自由脂肪酸生成少，而且相對于其他中性脂，自由脂肪酸由于極性較高，提取效率較低。酶輔助法油脂的酸值可滿足堿催化酯交換反應(yīng)制備生物柴油的要求[29]。

表1 總油脂和酶輔助法油脂的脂肪酸組成Table 1 Fatty acid compositions of the total lipids and lipids extracted by enzyme-assisted

3 結(jié)論

本文在10 L 規(guī)模下驗(yàn)證了酶輔助提取R.toruloides 油脂工藝的有效性，通過多次萃取，油脂提取率和物料回收率均達(dá)到90%以上。該法對設(shè)備要求低，油脂提取率高，放大適應(yīng)性好，具有很好的工業(yè)化應(yīng)用潛力。

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