古紹彬，龔慧，楊彬，卜美玲

河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽 471023

1968年，Cruickshank 等對真菌誘導(dǎo)子進行了首次報道，他們從叢梗孢菌中分離得到了第一種真菌誘導(dǎo)子Monilicolin A，并發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)菜豆內(nèi)果皮形成和菜豆素積累[1]。隨后，真菌誘導(dǎo)子在植物與真菌相互作用的病理學(xué)機制的研究受到了廣泛關(guān)注。近年來利用真菌誘導(dǎo)子在提高藥用植物培養(yǎng)物中天然產(chǎn)物的產(chǎn)率，促進微生物次級代謝產(chǎn)物的積累等方面研究取得了可喜的進展。

1 真菌誘導(dǎo)子在植物細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用

采用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物，是保護瀕危藥用植物資源，解決藥用植物資源日益短缺最有效的途徑。在植物細(xì)胞培養(yǎng)中，通過添加誘導(dǎo)子可顯著促進細(xì)胞生長、大量促使次生代謝產(chǎn)物，尤其是在萜類、生物堿類、皂苷類、黃酮類、多酚類等化合物的生物合成。表1給出了近年來各種真菌誘導(dǎo)子在植物細(xì)胞生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用情況。

1.1 在萜類化合物生物合成中的應(yīng)用

紫杉醇(Taxol)是一類重要萜類化合物，能有效地治療晚期卵巢癌、乳腺癌及非小細(xì)胞肺癌等。張長平等[2]在南方紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，加入尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum 誘導(dǎo)子，短期內(nèi)激發(fā)細(xì)胞的防御性反應(yīng)，培養(yǎng)基發(fā)生堿化，苯丙氨酸酶(PAL)活力顯著提高，紫杉醇合成明顯加強。Li 等[3]利用美麗鐮刀菌 Fusarium mairei 濃縮培養(yǎng)液(去菌絲)處理東北紅豆杉懸浮細(xì)胞，同樣觀察到培養(yǎng)基堿化、PAL 激活現(xiàn)象，紫杉醇含量達到了25.63 mg/L。而Khosroushahi等[4]卻發(fā)現(xiàn)采用分階段培養(yǎng)和混合誘導(dǎo)的方式可大幅度提高紫杉醇的含量，在紅豆杉懸浮細(xì)胞生長階段結(jié)束后向培養(yǎng)基中加入茉莉酸、水楊酸及根霉Rhizopus stolonifer 誘導(dǎo)子，可使產(chǎn)量達到了39.5 mg/L。Xu 等[5]發(fā)現(xiàn)，由桔青霉Penicillium citrinum 細(xì)胞壁制備的誘導(dǎo)子可誘導(dǎo)紅豆杉懸浮細(xì)胞通過NOS 產(chǎn)生NO，NO 作為信號分子活化PAL 并觸發(fā)紫杉醇生物合成。

1.2 在生物堿生物合成中的應(yīng)用

喜樹堿和長春堿是一類重要植物抗癌藥物，通常從天然植物中獲取，但含量極低，近年來利用誘導(dǎo)子誘導(dǎo)生物堿的合成備受關(guān)注。潘學(xué)武等[6]發(fā)現(xiàn)由米根霉Rhizopus oryzae 制備的誘導(dǎo)子，可顯著提高喜樹堿的生物合能力，當(dāng)誘導(dǎo)子濃度達到30 mg/L 時，喜樹堿總產(chǎn)量最高達到14.1 mg/L。Eilert 等[7]利用瓜果腐霉Pythium apbanidermatum 和深紅酵母Rhodotorula rubs 菌體勻漿液處理長春花懸浮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子加入12 h 后生物堿含量急劇增加，其中瓜果腐霉誘導(dǎo)子可顯著提高色氨酸脫羧酶和異胡豆苷合成酶的活性；5%瓜果腐霉誘導(dǎo)子處理18 h，異胡豆苷內(nèi)酰胺、阿馬堿和長春堿產(chǎn)量分別達到27、10和13μg/g。Namdeo 等[8]在長春花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，加入黑曲霉 Aspergillus niger、鐮刀霉Fusarium moniliforme 和綠色木霉Trichoderma viride 細(xì)胞壁水解物，發(fā)現(xiàn)阿瑪堿的量提高了3倍。張向飛等[9]利用鐮刀菌Fusarium solani 和黑曲霉Aspergillus niger 的勻漿液對長春花愈傷組織進行誘導(dǎo)處理，結(jié)果顯示兩種真菌誘導(dǎo)子對吲哚總堿及阿瑪堿和長春堿的積累均有明顯的正向調(diào)節(jié)作用，其中黑曲霉誘導(dǎo)子使阿瑪堿含量增加了1.6倍，鐮刀菌誘導(dǎo)子使長春堿含量提高了近3倍。Zhao 等[10]分別用12種真菌菌體

勻漿液刺激長春花細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同來源的誘導(dǎo)子可引起長春花細(xì)胞內(nèi)不同類型吲哚生物堿的積累。Tang 等[11]最近報道利用長春花內(nèi)生真菌尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum 菌體制備的誘導(dǎo)子使懸浮培養(yǎng)的長春花細(xì)胞總生物堿含量達到了693.76μg/g 的最高水平。

表1 近年真菌誘導(dǎo)子在植物細(xì)胞生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物生物合成中的應(yīng)用Table 1 Application of fungal elicitors in secondary metabolites produced by plant cells in recent years

1.3 在三苷皂甙、甾體皂苷生物合成中的應(yīng)用

三萜皂甙、甾體皂苷(Saponin)是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，具有抗菌、解熱、鎮(zhèn)靜、抗癌等功效，利用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)皂甙的研究已有不少報道。早在1992年，方綺民等[12]就利用7種真菌菌絲體勻漿作為誘導(dǎo)子，添加到懸浮培養(yǎng)的西洋參中，發(fā)現(xiàn)除煙曲霉誘導(dǎo)子外其他6種真菌誘導(dǎo)子均能促進西洋參細(xì)胞皂甙的合成，且尤以葡枝根霉菌最明顯，該誘導(dǎo)子作用下皂甙含量增加了2倍。劉長軍等[13]利用刺盤抱菌Colletotrichum nicoltianae 菌絲體誘導(dǎo)子處理西洋參細(xì)胞后總皂甙增加到679 mg/L，且85%的皂甙排到培養(yǎng)液中。Lu等[14]將酵母提取物添加到西洋參懸浮細(xì)胞中，當(dāng)添加濃度達到3 g/L 時，皂甙總含量提高了20倍。趙俊云等[15]用刺囊毛霉Mucor spinosus 菌絲體制備的誘導(dǎo)子處理桔梗懸浮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)總皂甙含量提高了1.5倍。劉娟等[16]將鐮刀菌Fusarium solani 菌體制備的誘導(dǎo)子添加到盾葉薯蕷培養(yǎng)物中，結(jié)果薯蕷皂素的含量提高了2倍。而Karwasara[17]等分別將黑曲霉Aspergillus niger 和根霉Rhizopus stolonifer 的培養(yǎng)液(除菌體)加入到相思子Abrus precatorius 培養(yǎng)物中，結(jié)果甘草皂苷含量分別提高了4.9倍和3.8倍，而用菌絲體制備的誘導(dǎo)子卻對皂苷的含量幾乎沒有影響。

1.4 在黃酮類化合物生物合成中的應(yīng)用

黃酮類化合物(Flavonoids)是一類含有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物，具有抗氧化、抗衰老、抗癌、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、調(diào)節(jié)心血管、抗炎、抗過敏、抗病毒等多種生物活性。Park 等[18]發(fā)現(xiàn)在野葛Pueraria lobata 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中用酵母提取物處理時，在24 h 內(nèi)能觀察到異黃酮類化合物含量的顯著升高。Hao 等[19]用真菌Sphaeropsis sp.B301制備的誘導(dǎo)子處理懸浮培養(yǎng)的銀杏細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)ABA 含量和PAL 活性顯著增加，銀杏黃酮的含量成倍提高。Xu 等[20]發(fā)現(xiàn)真菌誘導(dǎo)子還可通過茉莉酸(JA)介導(dǎo)的植物防疫系統(tǒng)來促進銀杏細(xì)胞黃酮類化合物的積累。楊世海等[21]在甘草愈傷組織中加入適量的黑曲霉誘導(dǎo)子，使黃酮類化合物含量達到了149.58μg/g，而0.1%的酵母提取物可使培養(yǎng)物中甘草查爾酮含量提高7.5倍。

1.5 在紫草素及衍生物生物合成中的應(yīng)用

紫草素及其衍生物是來源于紫草，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等功效的一類化合物。寧文等[22]將一種曲霉屬真菌誘導(dǎo)子加入到懸浮培養(yǎng)的滇紫草Onosma paniculatum 中，發(fā)現(xiàn)紫草素含量增加了2倍。劉長軍等[23]分別用刺盤孢菌Colletotrichum nicotianae、尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、黑曲霉 Aspergillus niger、米曲霉Aspergillus oxyzae 菌體制備的誘導(dǎo)子處理新疆紫草Arnebia euchroma 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)4種誘導(dǎo)子均能提高紫草素含量，其中黑曲霉誘導(dǎo)子效果最為明顯，加入該誘導(dǎo)子6 h 后，紫草細(xì)胞內(nèi)PAL活性明顯增強，培養(yǎng)液中紫草素含量也隨之增加，48 h 后達到84.8 mg/L；Yazaki 等研究發(fā)現(xiàn)PAL 活性與紫草素積累呈正相關(guān)。而傅旭慶等[24]同時用黑曲霉 Aspergillus niger 和米根霉Rhizopus oryzae 菌粉制備的誘導(dǎo)子處理新疆紫草懸浮細(xì)胞時，紫草素的產(chǎn)量達到了245.68 mg/L。Wu 等[25]研究發(fā)現(xiàn)真菌誘導(dǎo)子可影響紫草胞內(nèi)NO 分子的合成，后者進一步上調(diào)紫草素生物合成途徑中的PAL、PGT 和HMGR 的表達，從而促進紫草素的大量積累。

1.6 在鬼臼毒素生物合成中的應(yīng)用

鬼臼毒素是從小蘗科鬼臼屬植物中提取的一種復(fù)雜的多酚類抗腫瘤成分。Esmaeilzadeh等[26]分別用禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum、匍莖根霉菌 Rhizopus stolonifer、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、綠色木霉Trichoderma viride、核盤菌Sclerotinia sclerotiorum 菌絲體制備的真菌誘導(dǎo)子處理短柄野芝麻Lamium album 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5種真菌誘導(dǎo)子均能促進胞內(nèi)鬼臼毒素的合成，其中禾谷鐮刀菌誘導(dǎo)子使鬼臼毒素產(chǎn)量提高了7倍還多，產(chǎn)量達到140μg/g 細(xì)胞干重。進一步研究發(fā)現(xiàn)真菌誘導(dǎo)子可能通過上調(diào)與木酚素生物合成途徑相關(guān)的基因，如落葉松樹脂醇還原酶(PLR)，肉桂酰輔酶A 還原酶(CCR)，肉桂醇脫氫酶(CAD)和PAL 等的表達促進鬼臼毒素的大量合成[27]。

2 真菌誘導(dǎo)子在微生物發(fā)酵生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用

目前利用真菌誘導(dǎo)子處理植物細(xì)胞培養(yǎng)物，大量合成次級代謝產(chǎn)物的報道較多，而利用其誘導(dǎo)微生物積累次生代謝方面的研究卻相對較少。隨著細(xì)菌和真菌基因組研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)通過某些小分子的刺激可激活胞內(nèi)一些沉默途徑(Silent pathways)，尤其是一些次級代謝產(chǎn)物合成的基因簇，從而獲得比傳統(tǒng)發(fā)酵更多的代謝產(chǎn)物[28]。因此，近年來有研究者在利用真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)微生物生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物方面進行了大膽嘗試，并在類胡蘿卜素、海洋生物堿、靈芝多糖和靈芝酸、Monacolin K 和DMA 等方面取得了許多可喜成果。

2.1 在色素生物合成中的應(yīng)用

類胡蘿卜素是一類重要的天然色素，具有良好的抗突變、抗癌、防衰老、防輻射等功效。2002年，Han 等[29]研究了6種真菌誘導(dǎo)子對青霉PT95(Penicillium sp.PT95)菌核生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)率的影響，發(fā)現(xiàn)它們均能使菌核生物量、類胡蘿卜素含量大幅增加，其中深紅酵母誘導(dǎo)子使每100 g 玉米粉中菌核產(chǎn)量達到了15.90 g，紫紅曲霉誘導(dǎo)子使PT95類胡蘿卜素和β-胡蘿卜素產(chǎn)量分別提高了2.76和2.72倍。Wang 等[30]報道了6種不同真菌誘導(dǎo)子對法夫酵母Xanthophyllomyces dendrorhous 產(chǎn)類胡蘿卜素和蝦青素的影響，發(fā)現(xiàn)30 mg/L 的高大毛霉Mucor mucedo 誘導(dǎo)子可使胞內(nèi)總類胡蘿卜素含量提高78.87%，30 mg/L 粘紅酵母Rhodotorula glutinis誘導(dǎo)子可使蝦青素含量提高90.60%；而相同濃度的深紅酵母Rhodotorula rubra 誘導(dǎo)子卻可同時使胡蘿卜素和蝦青素分別提高42.24%和69.02%。2008年，汪文俊等[31]報道了貝殼狀革耳菌 Panus conchatus、雜色云芝 Coriolus versicolor 制備的誘導(dǎo)子對紅法夫酵母 Phaffia rhodozyma 菌體生長、總類胡蘿卜素合成有顯著促進作用，當(dāng)添加誘導(dǎo)子濃度分別為30 mg/L 和10 mg/L 時，總類胡蘿卜素產(chǎn)量分別比對照提高了47.3%和26.2%；進一步研究中發(fā)現(xiàn)在添加誘導(dǎo)子后胞內(nèi)活性氧(ROS)含量顯著增加，而ROS可能進一步激活了蝦青素生物合成途徑中相關(guān)酶或基因表達。

核叢青霉素是由 Michael 等從菌核青霉Penicillium sclerotiorum 分離獲得的一種新真菌色素，具有內(nèi)皮素受體結(jié)合能力，真菌類厚壁孢子細(xì)胞誘導(dǎo)活性，膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白活性抑制作用，以及對脂肪酶和磷脂酶A2等具有抑制作用。Raina 等[32]將培養(yǎng)48 h 的菌核青霉IMI104602培養(yǎng)液乙酸提取物加入到該菌發(fā)酵液中，168 h時核叢青霉素產(chǎn)量達到8.5 mg/L。而將該提取物加入到另一株菌核青霉IMI040574時，核叢青霉素含量提高6.4倍。進一步研究發(fā)現(xiàn)該提取物中multicolic acid 通過作用于菌體的群體感應(yīng)系統(tǒng)，并引起相關(guān)基因表達，從而刺激了次級代謝產(chǎn)物核叢青霉素的大量積累。為此，Raina 提出了利用微生物與自身間，或與其他微生物間和環(huán)境間的通訊實現(xiàn)對生物活性成分的大量積累以提高發(fā)酵水平的一種新策略[33]。

2.2 在靈芝三萜和靈芝多糖合成中的應(yīng)用

靈芝三萜具有解毒、抑腫瘤等活性，是一種難以人工合成的活性物質(zhì)。Zhu 等[34]以尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum、黑曲霉 Aspergillus niger 、桔青霉Penicillium citrinum 和釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae 四種真菌菌絲體為材料，制備了含蛋白、脂類和多糖，含蛋白和多糖，以及只含多糖的誘導(dǎo)子，然后用其處理深層培養(yǎng)的靈芝，發(fā)現(xiàn)由夏塊菌制備的含蛋白、多糖和脂類，以及只含多糖的誘導(dǎo)子可顯著提高靈芝胞外多糖產(chǎn)量；由中國塊菌制備的同時含多糖和蛋白的誘導(dǎo)子可極大提高靈芝胞內(nèi)多糖含量，且使產(chǎn)量達到了(1.94±0.18) g/L；而黑孢塊菌制備的含蛋白和多糖的誘導(dǎo)子可促進靈芝三萜合成，但由該菌制備的僅含多糖的誘導(dǎo)子卻抑制該產(chǎn)物的產(chǎn)生；不過從桔青霉中分離出來的多糖卻能明顯促進靈芝三萜的大量積累，且最高產(chǎn)量可達(315.5±12.4) mg/L。高興喜等[35]研究木素木霉Trichoderma viride、蘑菇輪枝孢 Verticillium psalliotae 和頂頭孢霉Acrrmonium strictum 誘導(dǎo)子對靈芝多糖和三萜類物質(zhì)積累的影響，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子種類、濃度和添加時間對靈芝多糖和三萜類物質(zhì)的產(chǎn)量均有影響，當(dāng)發(fā)酵初期或中期加入120μg/mL 頂頭孢誘導(dǎo)子時，靈芝多糖和三萜類物質(zhì)的積累最高。

2.3 在Monacolin K 和DMA 合成中的應(yīng)用

Monacolin K，也稱洛伐他汀，是紅曲中的重要活性物質(zhì)，具有健脾消食、活血化淤等功效。Sun 等[36]將花溪擲孢酵母 Sporobolomyces huaxiensis 培養(yǎng)液(除菌體)加入處于對數(shù)期的紫紅曲霉發(fā)酵液中，結(jié)果在誘導(dǎo)加入第4天獲得最高Monacolin K 的產(chǎn)量，達446.92 mg/mL。劉愛英等[37]將一種擔(dān)子菌的無性型液體發(fā)酵物Hxa加入到紫色紅曲霉Monascus purpureus ZZ 固態(tài)發(fā)酵及液態(tài)培養(yǎng)基中，結(jié)果使該菌Monacolin K含量分別達到了達34.99 mg/g 和1330.4μg/mL。鄒曉等[38]利用白黑粉菌Ustilago esculenta Henn與紫紅曲霉Monascus perpureuss Went 共同培養(yǎng)，在培養(yǎng)到第8天洛伐他汀產(chǎn)量提高了203%。

D M A ，也稱去乙酰真菌環(huán)氧乙酯(Deacetylmycoepoxydiene)，是由黃耀堅教授課題組在紅樹林內(nèi)生真菌擬莖點霉Phomopsis sp.A123中分離出的一種新的次級代謝產(chǎn)物，具有較好的抗腫瘤活性。該課題組研究了枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis CMCC(B)63501、白色假絲酵母菌Candida albicans AS2.538、黑曲霉Aspergillus niger 和糖單胞菌Saccharomonspora sp.細(xì)胞壁提取物對DMA合成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白色假絲酵母提取物能顯著提高去乙酰真菌環(huán)氧乙酯的產(chǎn)量，推測該誘導(dǎo)子作為異己成分被139菌膜上的受體識別，激發(fā)了菌株的自我防御機制，導(dǎo)致代謝物DAM 增加[39]。

表2 近年真菌誘導(dǎo)子在微生物發(fā)酵生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用Table 2 Application of fungal elicitors in secondary metabolites produced by microbial fermentation in recent years

2.4 在樺褐孔菌多酚中的應(yīng)用

樺褐孔菌是一種能夠治療多種疾病的藥用真菌,其中酚類化合物被認(rèn)為是治療和預(yù)防氧化脅迫誘導(dǎo)的糖尿病、高血壓、癌癥及老年癡呆癥的有效成分。鄭維發(fā)等[40]利用斑孔木層孔菌Phellinus punctatus 與樺褐孔菌Inonotus obliquus共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在菌體生物量下降的情況下多酚復(fù)合物的積累卻明顯增加。趙艷霞等[41-42]用鏈孢霉Alternaria alternate (Fr.) Keissler 制備的真菌多糖對深層培養(yǎng)的樺褐孔菌進行處理，發(fā)現(xiàn)真菌誘導(dǎo)子可顯著提高樺褐孔菌菌絲體多酚含量，當(dāng)誘導(dǎo)子添加量為45μg/mL 時，樺褐孔菌菌絲體多酚的積累量達到46.5 mg/g。進一步研究證實該真菌誘導(dǎo)子可能通過作用于NO 信號分子而影響樺褐孔菌多酚的形成，而NO 分子在介導(dǎo)樺褐孔菌多酚生物合成途徑中發(fā)揮著重要作用[43]。

2.5 在納他霉素中的應(yīng)用

納他霉素(Natamycin)是一種高效、廣譜的大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌抗生素。江南大學(xué)史強[44]研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉 Aspergillus niger 和產(chǎn)黃青霉Penicillium chrysogenum 的培養(yǎng)液(除菌體)能顯著促進納塔爾鏈霉菌Streptomyces natalensis 產(chǎn)生納他霉素，并初步確定該誘導(dǎo)子可能為有機酸或氨基酸類小分子化合物。本實驗室也發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黃青霉誘導(dǎo)子能顯著提高納他霉素產(chǎn)量，在納他霉素發(fā)酵的第24 h 時加入，產(chǎn)量可提高近2倍。此外還觀察到產(chǎn)γ-亞麻酸的刺孢小克銀漢霉Cunninghamella echinulata 發(fā)酵液能誘導(dǎo)納他霉素的合成，使Natamycin 產(chǎn)量比對照提高了近1倍，推測刺孢小克銀漢霉發(fā)酵液的短鏈脂肪酸、乙酰輔酶A 等，可能參與了納他霉素合成的代謝調(diào)控，從而縮短了生物合成周期，提高了產(chǎn)量。

3 真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)植物和微生物細(xì)胞合成次生代謝產(chǎn)物的作用機理

3.1 誘導(dǎo)子對植物細(xì)胞培養(yǎng)中次生代謝物合成的調(diào)控機制

現(xiàn)有研究證實，誘導(dǎo)子在植物細(xì)胞培養(yǎng)中首先被細(xì)胞膜表面受體識別，然后通過信號傳導(dǎo)途徑完成信號的跨膜傳遞，并引起基因表達發(fā)生變化，從而調(diào)節(jié)植物次生代謝產(chǎn)物合成途徑中相關(guān)酶活性，促進特定次生代謝產(chǎn)物的生成和積累。

3.1.1 信號識別

通常情況下，真菌誘導(dǎo)子首先與植物細(xì)胞質(zhì)膜上特定的受體結(jié)合，然后再專一、快速地誘導(dǎo)特定基因表達，從而促進次生代謝產(chǎn)物合成。目前人們對β-葡聚糖的結(jié)合蛋白研究較為深入，1983年Yoshkawa[45]首先證實了大豆原生質(zhì)膜上有誘導(dǎo)子受體的存在，隨后Schmidt 等[46]發(fā)現(xiàn)3H標(biāo)記的來自大豆疫霉菌的β-葡聚糖與大豆細(xì)胞膜制備物具有不同程度的親合力，這種親合力具有飽和性和可逆性，誘導(dǎo)子活性較高的3H 葡聚糖與膜的親合力也大。目前，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種存在于植物細(xì)胞膜上的真菌誘導(dǎo)子的親和受體蛋白，如在煙草和番茄的細(xì)胞膜上存在的受體蛋白，它們能與真菌誘導(dǎo)子結(jié)合并誘導(dǎo)木聚糖酶的活性，歐芹Petroselinum crispum Mill1細(xì)胞質(zhì)膜上也存在大豆疫霉菌誘導(dǎo)子活性成分的結(jié)合位點。此外誘導(dǎo)子本身的結(jié)構(gòu)形式也影響受體的識別，Vargas 等[47]發(fā)現(xiàn)蛋白類真菌誘導(dǎo)子Sm1和Ep11的寡聚體可以被玉米細(xì)胞表面受體識別，但它們的二聚體卻不能被細(xì)胞識別并激發(fā)后續(xù)的防御反應(yīng)。

3.1.2 信號跨膜傳遞

誘導(dǎo)子與細(xì)胞膜上的受體蛋白識別結(jié)合后，可引起離子通道的開啟或關(guān)閉，蛋白磷酸化，或G-蛋白偶聯(lián)等，并進一步激活第二信使系統(tǒng)實現(xiàn)信號的跨膜傳遞。

眾多研究證實，Ca2+和H+的內(nèi)流以及Cl-和K+外流是誘導(dǎo)子作用下植物細(xì)胞共有的現(xiàn)象。Salzer 等[48]報道黑挪威云杉Picea abies L 懸浮細(xì)胞經(jīng)真菌誘導(dǎo)子處理后，會快速引起Cl-和K+外流，以及Ca2+內(nèi)流和培養(yǎng)基堿化等。張長平等[2]用尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子對紅豆杉細(xì)胞進行誘導(dǎo)，也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜上的Ca2+、H+內(nèi)流和Cl-、K+外流現(xiàn)象。Blume 等[49]用大雄疫霉糖蛋白處理歐芹細(xì)胞，觀察到胞質(zhì)Ca2+釋放和大量Ca2+內(nèi)流。Zhao 等[10]用真菌誘導(dǎo)子處理長春花細(xì)胞時，觀察到鈣的釋放，以及由此而引起ROS 的產(chǎn)生。

有研究表明蛋白質(zhì)磷酸化過程也參與了誘導(dǎo)子與植物細(xì)胞間的信號傳遞，Menke 等[50]發(fā)現(xiàn)酵母誘導(dǎo)子處理長春花細(xì)胞時，誘導(dǎo)子可促進茉莉酸的合成和色氨酸脫羧酶和異胡豆苷合成酶基因(tdc 和str)的表達，而蛋白激酶抑制劑K-252a 可完全阻斷由誘導(dǎo)子引起的起茉莉酸的合成和 tdc 和 str 的表達。Suruki 等[51]利用P.infestan 細(xì)胞壁制成的誘導(dǎo)子處理煙草細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子可快速激活MBP 激酶并進一步引起MBP 蛋白的磷酸化。Peck 等[52]采用雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)真菌誘導(dǎo)子處理擬南芥細(xì)胞數(shù)分鐘后就能觀察到細(xì)胞中的磷酸化過程。Dietrich 等[53]在利用大豆疫霉 Phytophthora megasperma f.sp.glycinea 誘導(dǎo)子處理歐芹時，發(fā)現(xiàn)僅處理1 min 后就能在細(xì)胞質(zhì)和微粒體中檢測到45 kDa 的蛋白質(zhì)的磷酸化。

植物細(xì)胞內(nèi)的GTP 結(jié)合蛋白在負(fù)責(zé)將質(zhì)膜表面受體和質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的效應(yīng)器偶聯(lián)中發(fā)揮著重要的作用。Zhao 等[54]在柏木Cupressus lusitanica細(xì)胞培養(yǎng)中加入酵母誘導(dǎo)子，發(fā)現(xiàn)Ca2+和G 蛋白介導(dǎo)了酵母誘導(dǎo)子的信號途徑，G 蛋白所有的抑制劑對誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的脂氧化酶的活性起抑制作用，而G 蛋白激活劑則可增強脂氧化酶的活性，最終使植物抗毒素扁柏醇的產(chǎn)量提高。另外，植物小G 蛋白可能也是植物防御途徑中重要的一員，結(jié)合在膜上的小G 蛋白首先活化磷酸脂酶，并進一步引起ROS 的釋放，ROS 可通過脂氧合酶途徑合成茉莉酸等小分子進而激活和調(diào)控下游相關(guān)防御基因的表達，促進次生代謝產(chǎn)物合成。

此外，NO 也可能參與了刺激信號從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到核內(nèi)，誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)生理生化效應(yīng)并促進次級代謝產(chǎn)物生成。Xu 等[4]研究發(fā)現(xiàn)NO是參與紅豆杉細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物合成調(diào)控的一種新的信號分子，它可依賴JA、ROS 等信號途徑觸發(fā)植物細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的合成，且NO 和JA 信號分子之間存在著特殊的自催化協(xié)同放大效應(yīng)。Wu 等[25]也證 NO 在介導(dǎo)禾谷絲核菌Rhizoctonia cerealis 誘導(dǎo)子誘導(dǎo)實滇紫草Onosma paniculatum 合成紫草素中發(fā)揮著重要作用，NO 淬滅劑L-NNA 可有效抑制真菌誘導(dǎo)子對NO 迸發(fā)的誘發(fā)作用，還可阻斷誘導(dǎo)子對滇紫草細(xì)胞中紫草素合成的促進作用。

3.1.3 跨膜信號介導(dǎo)的胞內(nèi)應(yīng)答

誘導(dǎo)子的刺激信號，經(jīng)跨膜傳遞并產(chǎn)生了包括Ca2+、ROS 和植物激素等在內(nèi)的胞內(nèi)第二信使，在這些信號作用下，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物合成途徑中相關(guān)酶的基因表達，改變酶活性，從而提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。Zhao 等[55]發(fā)現(xiàn)酵母誘導(dǎo)子通過第二信使IP3，促使Ca2+通道的打開，使磷脂酶C 的活性增強，從而激活多聚磷酸肌糖的生物合成途徑，提高鼠尾草抗毒素的產(chǎn)量。Menke 等[50]則發(fā)現(xiàn)酵母誘導(dǎo)子通過蛋白激酶的影響控制JA 合成，而后者又調(diào)控著tdc 和str 的表達，從而影響長春花細(xì)胞生物堿的合成；而Zhao 等[56]證實黑曲霉誘導(dǎo)子通過作用于長春花細(xì)胞鈣離子的內(nèi)流和鈣依賴的信號傳遞途徑，影響植物細(xì)胞的氧化猝發(fā)，而氧化猝發(fā)和H2O2的產(chǎn)生與吲哚生物堿的合成密切相關(guān)。Szabo 等[57]利用腐病菌誘導(dǎo)子處理彩葉草細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)子通過作用于JA 合成途徑來提高4-香豆酸：輔酶A 連接酶(4CL)、PAL、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)的活性，從而使迷迭香酸產(chǎn)量提高了大約3倍。Xu 等[4]則發(fā)現(xiàn)，桔青霉誘導(dǎo)子可誘導(dǎo)紅豆杉懸浮細(xì)胞產(chǎn)生NO，NO 作為信號分子活化PAL 并觸發(fā)紫杉醇生物合成。

3.2 誘導(dǎo)子在微生物細(xì)胞培養(yǎng)中次生代謝物合成的調(diào)控機制

真菌誘導(dǎo)子與微生物細(xì)胞間相互作用的研究相對滯后，在2001年Liu 等[58]才初次報道海藻酸鈉(Alginate,(C6H7NaO6) n)可通過某種調(diào)節(jié)蛋白介導(dǎo)的信號傳遞途徑作用于pcbAB、pcbC和penDE 基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而誘導(dǎo)產(chǎn)黃青霉菌Penicillium chrysogenum 合成青霉素。為能理解誘導(dǎo)子與微生物細(xì)胞間的相互作用過程，Radman 等[59]基于植物防御反應(yīng)過程，以及人們對酵母和真菌質(zhì)膜上的受體、G-蛋白偶聯(lián)受體、胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白、cAMP 和 Ca2+等第二信使和MAPK、PKC 等途徑的研究的結(jié)果，構(gòu)建了誘導(dǎo)子與微生物細(xì)胞間的作用模型(圖1)。Radman認(rèn)為當(dāng)誘導(dǎo)子結(jié)合上微生物細(xì)胞表面受體時，首先會快速引起細(xì)胞膜的去極化，并導(dǎo)致離子通道的開啟，使Cl-和K+外流，鈣和H+內(nèi)流，胞內(nèi)環(huán)境的異常變化促使ROS 的生成，后者作為第二信使調(diào)控下游相關(guān)基因的表達，促進次生代謝產(chǎn)物合成。其次，誘導(dǎo)子與受體相互作用時，可引起G-蛋白介導(dǎo)的磷酸二酯酶(Phophodiesterase)的活化，并導(dǎo)致三磷酸肌醇(IP3)和二酯酰甘油(DAG)的釋放，隨后IP3將使細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和液泡上Ca2+通道開啟，使Ca2+濃度升高，進而促使PKC 轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜內(nèi)表面并被膜上DAG 活化后啟動PKC-MPKA 信號途徑；同時Ca2+還可與鈣調(diào)蛋白結(jié)合激活鈣調(diào)蛋白激酶，并影響核基因轉(zhuǎn)錄等。第三，誘導(dǎo)子還可引起G-蛋白介導(dǎo)腺苷酸環(huán)化酶活化，使得胞內(nèi)cAMP 變化并激活PKA 信號途徑。

圖1 誘導(dǎo)子在微生物細(xì)胞中的作用機制模型[50]Fig.1 Hypothetical mechanism of action of elicitors in microbial cell systems[50].

此外，Raina 等[32]還發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子可作用于菌體的群體感應(yīng)系統(tǒng)，并引起相關(guān)基因的表達，從而刺激了次級代謝產(chǎn)物的大量積累。Raina以此為基礎(chǔ)，最近提出了利用微生物與自身間，與其他微生物間和環(huán)境間的通訊實現(xiàn)對生物活性成分的大量積累作為提高發(fā)酵水平的一種新策略[33]。Zheng 等[60]發(fā)現(xiàn)來源于煙草赤星病菌Alternaria alternata 的誘導(dǎo)子可通過誘導(dǎo)NO 的產(chǎn)生而促進菌絲酚類化合物的積累，但NO 絕非通過類似于植物細(xì)胞中的oxylipins 或JA 信號途徑，其真正的作用機制有待進一步深入研究。

4 結(jié)論和展望

真菌誘導(dǎo)子主要是糖類、蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì)，它們通過與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合，然后通過信號傳導(dǎo)途徑完成信號的跨膜傳遞，引起細(xì)胞基因表達發(fā)生變化，從而調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中相關(guān)酶的活性，最終刺激細(xì)胞發(fā)生防御反應(yīng)，誘導(dǎo)特定次生代謝產(chǎn)物的生成和積累。在植物細(xì)胞培養(yǎng)中，特別是藥用植物中，人們通過不同真菌誘導(dǎo)子實現(xiàn)了對萜類、生物堿類、皂苷類、黃酮類等多種化合物的誘導(dǎo)合成，并取得了良好的經(jīng)濟和社會效益。另一方面，人們成功嘗試在微生物發(fā)酵中引入真菌誘導(dǎo)子的培養(yǎng)方法，實現(xiàn)對類胡蘿卜素、Sclerotiorin、靈芝多糖、靈芝三萜、Monacolin K、DMA 和natamycin 誘導(dǎo)合成。這些工作的開展為發(fā)酵工業(yè)開啟又一個重要的研究領(lǐng)域，更重要的是對于一些難以培養(yǎng)的植物細(xì)胞而言，利用誘導(dǎo)子策略在微生物細(xì)胞中大量合成植物細(xì)胞的一些重要次級代謝產(chǎn)物，將可能成為獲得重要藥用植物次級代謝產(chǎn)物的又一條有效途徑。

同時，我們也注意到在真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物合成方面還有許多值得深入研究的問題。第一，目前研究的真菌誘導(dǎo)子時，多以一類或多類物質(zhì)組成的混合物進行研究，因此不同類誘導(dǎo)子間，甚至同類誘導(dǎo)子間是否存在相互影響或相互作用尚不清楚。因此還應(yīng)開展誘導(dǎo)子組分中的功能性成分分離、純化和鑒定工作，這對特異性誘導(dǎo)子的篩選，以及誘導(dǎo)子與受體間作用機制的研究都尤為重要。第二，誘導(dǎo)子來源及誘導(dǎo)子結(jié)構(gòu)形式研究，尤其是蛋白類誘導(dǎo)子，是否進行糖基化和糖基化程度，以及它所處的高級結(jié)構(gòu)狀態(tài)，如寡聚體和多聚體等對誘導(dǎo)子與受體的結(jié)合有什么影響？第三，目的細(xì)胞表面誘導(dǎo)子受體情況，目前對寡糖類誘導(dǎo)子受體研究較多，其他類型誘導(dǎo)子受體的種類及分布情況如何，這些受體蛋白的表達受哪些因素的調(diào)控，誘導(dǎo)子與受體間的結(jié)合與哪些因素有關(guān)等都有待進一步研究。第四，在誘導(dǎo)子制備過程中，產(chǎn)誘導(dǎo)子菌體的培養(yǎng)條件、收獲時間及提取工藝對誘導(dǎo)子活性有什么影響？第五，在誘導(dǎo)子的添加過程中，誘導(dǎo)子的使用時間、使用條件等與目的細(xì)胞的狀態(tài)有何關(guān)系？因此，深入研究真菌誘導(dǎo)子與目的細(xì)胞相互作用，尤其是與微生物細(xì)胞相互作用時，對實現(xiàn)高效、特異誘導(dǎo)目的產(chǎn)物的生產(chǎn)，推動生物誘導(dǎo)子在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用都將具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。

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